牛津大学Small Methods：使用LLSM-FRAP量化复杂细胞形态中的分子动力学

原创潘奕辰 MaterialsViews

生物分子在活细胞中不断地经历反应和扩散动力学，量化这些动力学对表征和理解细胞功能非常重要。光漂白后的荧光恢复(FRAP)是量化分子动力学方面最成功和应用最广泛的方法之一，其具有亚秒级时间尺度上测量的多功能性、易于实施、可靠性高和无需专业设备的特性。典型的FRAP实验中，细胞内的特定区域通过短时间暴露在高功率激光下被漂白，并且随着时间的推移监测荧光标记分子的后续恢复。FRAP回收曲线的形状，即所谓的流动部分，捕捉了选定区域潜在分子动力学的复杂性。通过使用分子动力学的理论模型或数值模拟，结合相应分子恢复时间信息，可以推断出该区域的分子动力学。然而，传统的FRAP通常仅限于在亚细胞大小的区域内进行单平面图像采集，这限制了其研究具有大多数生物系统特征的复杂形状和几何形状内动力学的能力，例如质膜、细胞细胞器和肌动蛋白细胞骨架。为了解决复杂的3D细胞和亚细胞环境中的动力学问题，研究者最近提出将一种光片技术选择性平面照明显微镜与FRAP结合起来测量核内扩散的2D空间变化，被称为晶格光片显微镜 (LLSM) 。

近日，牛津大学Huw Colin-York与Marco Fritzsche团队通过研究细胞质膜形态不同区域中脂质和蛋白质的扩散动力学以及激活T细胞的皮质肌动蛋白网络，展示了LLSM、FRAP和数值模拟三者结合的能力和灵活性。

在本工作中，为了研究3D细胞形态背景下的分子动力学，研究团队使用了配备光漂白激光器的LLSM成像平台（上图a），除了控制光漂白的位置和大小外，还可以对活细胞内的目标区域进行快速的3D体积成像。

由于LLSM可以实现快速的体积采集，LLSM-FRAP能够捕获漂白剂的局部几何形状以及动态更广泛的细胞背景。与传统的宽场或共焦 FRAP 方法相比，该方法的关键优势在于有限的光学切片或轴向扫描速率可将这些模式限制在非常缓慢发展的生物现象中。动态量化的背景化能力对于确定已被漂白的确切结构以及漂白区域的局部环境（包括形态、物种密度和分布）至关重要，从而促进了更精确和定量的FRAP测量。通过将LLSM、FRAP与数值模拟分析相结合，作者证明了LLSM-FRAP能够提供跨细胞体积的分子动力学的定量测量。更重要的是，通过观察激活过程中T细胞膜不同区域内质膜的蛋白质和脂质成分的扩散，本工作展示了LLSM-FRAP评估细胞形态复杂区域内动态的潜力。