撰文 | 十一月
责编 | Qi
人多能干细胞包括人胚胎干细胞和诱导多能干细胞具有在体外自我组装形成3D结构类器官的能力。目前类器官在不同组织中的应用都有报道【1-3】，但是在心血管领域的进展却非常有限。在心血管微组织或者心脏类器官方面的研究主要是关于心肌细胞工程学方面的技术推进，比如如何工程化预分化的心血管细胞种类来模拟成体类似的心脏组织【4, 5】。这些类器官复制了人类心脏组织的某些方面，包括基质细胞、内皮细胞网和心外膜层，但不能反映早期心脏发育的过程。因此，关于心脏发育形态学方面的研究空白亟待补充。
2021年2月8日，来自德国汉诺威医学院的Robert Zweigerdt研究组在Nature Biotechnology杂志上发表题为 Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development 的文章，这项研究开发了能够概括早期心脏和前肠发育过程的人类心脏形成类器官。
想要建立早期发育相关的心脏类器官，首先需要对早期心脏发育过程有一定的了解。心脏是胚胎中首先形成的具有功能的器官，起源于脏壁中胚层（Splanchnic mesoderm）。在预心血管中胚层特化之后，子代在胚胎中线两侧形成双侧心脏形成区。心脏形成区的细胞穿过中线并融合到心脏管，心脏管由心肌层和心内膜两层细胞组成。之后，心脏管进行成环定位未来的心室结构。
在悬浮培养中，自由漂浮的人多能干细胞聚集细胞团在响应经典的WNT信号通路后可有效分化为高度纯化的心肌细胞【6, 7】。基于先前的研究，作者们建立了能够应用于心脏形成类器官的实验流程（图1）。该流程将一定数量的多能干细胞团包埋于基质胶（Matrigel），由此建立起来的具有一定尺寸3D心脏形成结构。通过逐渐进行的分化过程，14天左右的时间作者们得到了直径约2mm的类器官。
图1. 心脏形成类器官形成的实验方法
在得到相应的类器官后，作者们首先对该类器官能否概括早期心脏发育过程进行评估。NKX2.5-eGFP人胚胎干细胞报告基因形成环类似结构，可以作为心脏发育过程监控的报告因子【8】。利用该报告因子建立的心脏形成类器官在10天左右的时候会形成NKX2.5-eGFP阳性的心肌层（Myocardial layer, ML）以及NKX2.5-eGFP阴性的内核层（Inner core, IC）。通过免疫荧光染色以及活体成像追踪等方式作者们确认心脏形成类器官可以形成经典的三层心脏细胞层结构，该结构被松散排列的心肌细胞和ST（Septum transversum）样细胞覆盖，最终被间充质细胞包围，可以概括早期心脏发育过程的模式。通过CD31的免疫染色， 作者们确认在心脏形成类器官中形成了血管类似结构，进一步通过心内膜细胞标记物NFATc1的染色确认了心脏形成类器官中包含心内膜类似的细胞。
图2. NKX2.5-eGFP来源的心脏形成类器官形成经典的三层心脏结构
除了血管类似的结构外，作者们通过H&E染色发现心脏形成类器官中包含一些砖块样上皮细胞（Brick-like epithelial cells）的结构。通过SOX17、SOX2以及HNF4α细胞标记物的染色作者们确认建立的心脏形成类器官中还存在前肠内胚层的组织结构。进一步地，作者们通过微阵列分析和单细胞RNA测序确认心脏形成类器官中存在前-后轴中胚层的模式。
为了证明心脏形成类器官在模拟早期心脏发育的过程中的精确性，作者们希望能够在遗传学方面进行检测。为此，作者们检测了心脏形成类器官NKX2.5-KO在体外的表型能否模拟体内的表型。小鼠的组成性Nkx2.5 KO由于形态学缺陷导致早期胚胎死亡，包括心脏管循环失败【9】。而心室条件性Nkx2.5 KO小鼠可以存活，但是心脏传导以及形态学方面存在缺陷【10】。作者们确认了该工作建立的心脏形成类器官模型会形成类似于NKX2.5缺失导致的心肌细胞粘附减少和心肌肥大现象。
图3 心脏形成类器官可以概括心脏早期发育过程以及前肠的部分结构
总的来说，该工作建立了一个可以诱导人多能干细胞形成自主装的心脏形成类器官的稳健实验方法，成功构建的概率为88%。该心脏形成类器官可以形成具有心脏结构不同细胞层模式同时又具有前肠内胚层的结构。另外，作者们从细胞标记物以及遗传学、大数据测序等方面证明了该类器官模型的有效性和概括性。为未来的自动化的高通量药物筛选提供了重要工具，为研究人类胚胎发生机制、疾病建模和药物发现开辟了新的前景。
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41587-021-00815-9
制版人：十一
参考文献
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