生物反应器中的 -微载体细胞培养工艺
摘要
WAVE Bioreactor 系统多用于悬浮细胞的培养。然而，用于细胞治疗和疫苗生产的多种细胞为贴壁依赖型的，需要一个可贴附的生长表面。在本研究中，Cytodex 微载体被应用在 CellbagTM 生物反应器中以扩增 Madine-Darby Canine Kidney (MDCK)和 Vero细胞。为了优化细胞贴附，测试了两种细胞株的不同摇动混合条件。我们发现培养基成分对细胞贴附有显著的影响；例如在低血清培养基中的 MDCK 和 Vero细胞，用间歇式和连续摇动混合都可以使细胞贴附到微载体上。然而，在无血清条件下，Vero细胞在间歇式摇动混合下可以获得高贴壁率。生长在 WAVE Bioreactor系统中的MDCK细胞可以被放大到2 L和10 L工作体积。 细胞达到最大密度为3×106细胞/ml。Vero 细胞在 2 L 工作体积下的Cytodex 1和Cytodex 3微载体上培养，无血清条件下达到 1.4×106细胞/ml 最大密度。用转瓶同样条件可以获得相同密度的Vero细胞，WAVE中细胞生长速度更快。
数据显示 WAVE Bioreactor 系统是成功用于 MDCK 和 Vero 细胞微载体培养的通用平台，可以方便的进行规模放大，是对传统搅拌罐生物反应器或转瓶的一种快速和方便的替代系统。
介绍
与滚瓶 (Roller Bottle)中的细胞培养不同，贴壁细胞在微载体上的培养使它相对容易进行生产工艺的规模放大。此外，微载体使细胞能够在生物反应器中扩增，与多个小T型瓶等塑料培养容器相比，生物反应器可以提供更好的工艺参数自动控制，降低劳动强度的同时减少污染的危险。一次性生物反应器的使用减少了投资成本、提高灵活性（简化批次间的轮换准备等操作） ，消除了生产容器清洗验证的需要。
WAVE Bioreactor 系统是设计用于人、动物、植物和昆虫细胞培养的一次性发酵设备， 并可以用于细菌和真菌的培养。 WAVE Bioreactor系统不需要清洗或灭菌， 这减少了生物制药生产中工艺验证的需要。尽管WAVE Bioreactor 系统多用于悬浮细胞的培养，本文的研究表明WAVE反应器也适合微载体上贴壁细胞的培养。
本文描述了 MDCK 和 Vero 细胞在 WAVE Bioreactor 系统中 Cytodex 微载体上的培养。我们对微载体培养所必需的参数如最佳摇动混合条件和工作体积范围、细胞贴附效率、最大细胞密度以及从 2 L工作体积放大到10 L的可行性进行了深入研究。使用细胞特异性的参数如贴附、生长速率和最大细胞密度等，对 WAVE Bioreactor系统和转瓶培养进行了比较和评价。WAVE Bioreactor 系统中贴壁细胞培养的一般操作程序如图1所示。
图 1. WAVE Bioreactor 系统中微载体培养工艺流程图
材料和方法
细胞株，培养基和储存液 MDCK细胞来自ECACC (Nr. 84121903)。细胞培养在含有 2% FBS (CH30160.03, HyClone)的 UltraMDCK (12-749Q, Lonza)培养基中。细胞在T型瓶和细胞工厂中的常规培养和微载体培养中的接种过程中，MDCK 细 胞 先 用 PBS-EDTA (E8008, Sigma Aldrich)洗涤，然后用 accutase 酶(L11007, PAA Laboratories)进行消化。
Vero细胞来自ATCC (Nr. CCL 81)。使用DMEM/Ham’s 为基础的无血清培养基进行培养。使用含0.2% Pluronic F68 (Sigma Aldrich)的培养基在WAVE Bioreactor 系统中进行细胞括增。在T型瓶和细胞工厂的常规培养中使用胰蛋白酶（Gibco BRL）消化细胞。源于大豆(1 mg/ml in PBS)的胰蛋白酶抑制剂STI (Sigma Aldrich)和EDTA用于胰蛋白酶消化的终止。Vero细胞在接种到微载体之前用0.02% EDTA 消化。然后补加培养基。
培养容器 在常规培养中，MDCK细胞生长在T 型瓶和多层细胞工厂（Corning Life Sciences，Sigma Aldrich）中用于接种准备。
在常规培养中Vero 细胞生长在T型瓶和多层细胞工厂中，用于接种准备。在125 ml Techne转瓶(Spinner Flask, Bibby-Scientific Ltd)中进行细胞培养，工作体积为60 ml。Spinner Flask转瓶以50 rpm搅拌混合。
微载体 Cytodex 3微载体被用于MDCK细胞的贴壁培养，Cytodex 1 和 Cytodex 3 被用于Vero细胞的贴壁培养。微载体在硅化国的玻璃容器中进行水化和高压灭菌。在用不含Ca2+和Mg2+离子的PBS中洗涤3次后，微载体在121℃高压灭菌15 min，并在 4℃下无菌保存。微载体先用培养基洗涤并在接种前24 h转移到Cellbag中进行平衡。所使用的Cytodex 1和Cytodex 3 的量为3 g/l。为了防止微载体吸附到玻璃表面，转移瓶和转瓶都经过 Sigma Cote (Sigma Aldrich)硅化处理。
用于MDCK和 Vero细胞的生物反应器 WAVE Bioreactor 系统由一个带有一次性塑料细胞培养袋的摇动平台组成，配备CO2 气体混合器 (CO2MIX20) 或WAVEPOD™控制塔用于控制pH、温度、氧气和混合。MDCK细胞在Cellbag-10 L和Cellbag-50 L的WAVE Bioreactor System 20/50中培养。Vero细胞在Cellbag-2 L和Cellbag-10 L的WAVE Bioreactor System 20/50中培养 。WAVEPOD 控制塔用于pH、温度、氧气和混合等参数的监测和反馈控制。
染色溶液 使用溶解于0.1 M柠檬酸中的0.1%结晶紫细胞裂解缓冲液进行 MDCK和 Vero 细胞的细胞核计数。台盼蓝（0.1%溶解在PBS中）用于测定细胞活率。 对于Vero细胞， 用于细胞固定和微载体培养物显微镜观察的 Hematoxylin 苏木紫染料溶液 (Carl Roth GmbH)由 0.9 g苏木紫、0.18 g NaIO3、15.45 g Al K(SO4)2 ×12 H20、45 g 水合Chloralhydrate (Carl Roth GmbH) 和1 g 一水柠檬酸溶解于1 L的蒸馏水中配制而成。
细胞培养-MDCK细胞 MDCK细胞按照1:5到1:6每周传代两次。对于常规细胞培养和微载体接种，MDCK细胞先用 PBS-EDTA 洗涤，然后通过与Accutase酶在37℃孵育30 min使细胞从微载体上脱落。我们取出一部分脱落的MDCK 细胞样品并用 CEDEX (Innovatis)测定细胞活率，此结果被用于计算达到目标接种密度所需的细胞数量。使用转移瓶将悬浮细胞加入到Cellbag中。
细胞培养-Vero细胞 Vero 细胞按照 1:3 到 1:4 每周传代两次。在这种条件下，经过胰蛋白酶消化的微载体接种难度较大，因为胰酶容易削弱细胞贴附从而影响细胞在微载体上的铺展。因此， 细胞用含有0.02 % EDTA的无Ca 2+ 和Mg 2+的PBS 从细胞工厂表面消化。10 层细胞工厂用 PBS 洗涤，细胞用100 ml EDTA 溶液消化后在37℃孵育 20 min。孵育后，我们加入500 ml的细胞培养基并合并所有细胞层的接种物。我们抽取一部分细胞样品用细胞血球计数器计数。使用台盼蓝染色（0.1%台盼蓝溶于PBS）测定细胞活率。下一步，我们测定达到特定接种密度所需要的悬浮细胞量，然后转移瓶中的细胞通过无菌焊接加入到Cellbag中。
取样 每天对细胞取样以确定密度和形态。在取样前，适当提高反应器的搅拌速率以保证微载体均匀悬浮 （对Cellbag-2 L为16 rpm和12°，对Cellbag-10 L为18 rpm和5°）。在提高搅拌速率2 min后，从取样口取出4 ml载体悬液，同时反应器保持连续摇动。然后反应器的搅拌参数被恢复到细胞培养时的工作参数，将样品转移到离心管中。先沉降微载体，丢弃上清，将含有 Vero细胞的微载体重悬在1 ml 含有0.1%结晶紫的0.1 M柠檬酸溶液中，然后孵育1.5 h。释放出的细胞核用血球计数器计数。对于MDCK 细胞，载体重悬在含有0.1%结晶紫的柠檬酸和Triton X-100溶液中。然后载体悬液被漩涡振荡30 s，使用 Bürker chamber计数细胞核。
0.5 ml Vero细胞微载体悬液被转移到小离心管中。在微载体沉降后，丢弃上清，贴在微载体上的Vero细胞使用0.3 ml苏木紫溶液固定并染色。微载体在显微镜下放大100倍进行观察，用于显微拍照。
微载体培养的最佳工作体积 确定Cellbag-10 L和 Cellbag-50 L的最佳工作体积。培养袋中的推荐工作培养体积为最大推荐体积的40 %（即Cellbag-10 L为2 L，Cellbag-50 L为10 L）。微载体密度为3 g/l Cytodex 3，接种密度为0.3×106细胞/ml。对每种Cellbag和培养体积，分别测试以下摇动条件：10 rpm和5º、12 rpm和5º、14 rpm和5º和12 rpm and 6º。
微载体培养的最佳混合条件 对于工作体积为2 L的 Cellbag-10 L进行最佳混合的研究。在Cellbag-10 L中培养基和微载体在 37℃和 5%二氧化碳通气下平衡 2 h。按照 0.3×106细胞/ml 的初始密度接种， 并在细胞-微载体贴附阶段使用连续的摇动方式。细胞生长 18 h 达到大约0.6×106细胞/ml 的细胞密度后，以阶梯方式逐渐提高摇动速度。在 5º、6º 和7º 下分别对初始摇速12 rpm进行测试。 摇速按照阶梯方式每小时逐渐提高，直到细胞开始从微载体上脱落。
结果和讨论
微载体培养的最佳工作体积和混合速度的确定当我们使用 20%到 80%的Cellbag最大工作体积时，微载体培养可以产生均匀的微载体混合分布（图 2）。
图 2. 微载体培养的最佳工作体积
在工作体积小于 20%的 Cellbag 最大工作体积时，部分微载体有可能粘在 Cellbag上，而超过80%工作体积可能会产生不均匀的微载体混合。
图 3显示摇动角度为5º、6º和7º时所获得的微载体均匀混合。超过8 rpm的摇动速度产生均匀的微载体混合效果。在摇动速度为16 到 20 rpm时MDCK细胞从微载体上脱落。
图 3.确定获得均匀混合的微载体溶液所需的最低混合条件，以及使用Cellbag-10 L时细胞从微载体上脱落前的最大混合条件。Cellbag-10 L的混合条件和 Cellbag-50 L相似，50 L的 Cellbag使用6 rpm和7º就可以获得均匀混合。
MDCK细胞贴附微载体 (2% FBS)
研究的目的是为了找到在WAVE Bioreactor System 20/50（细胞培养体积达到 25L）中MDCK细胞贴附到Cytodex 3微载体的最佳条件，在培养前4 h 的贴壁阶段，我们比较了3种不同的混合方式：
1） 间歇混合：每 30 min 以 12 rpm 和 6º间歇混合2 min（图4），其他时间停止摇动；4 h 后采用连续摇动(10 rpm和 5º)
图 4.在10 L Cellbag中前4 h内，每30 min间歇混合2 min (12 rpm和6º) ，4h后采用连续摇动（10rpm和 5º）
2） 半间歇混合：每30分钟以12 rpm 和6º加速混合2 min，其他时间保持6 rpm 和3.3º的低速连续摇动。4 h后采用连续摇动(10 rpm和5º)
图 5.每30分钟（12 rpm和6º）加速混合2 min，然后（在6 rpm和3.3º）保持低速连续摇动混合，如此半间歇混合4 h。4 h后，混合参数被设置为 10 rpm和5º连续摇动。
3） 连续摇动混合：摇动速度8 rpm和5º。4 h后采用连续摇动(10 rpm和5º)
图 6.在Cellbag-10 L中前4 h培养以8 rpm和5º连续混合。4 h后混合参数被设置为10 rpm和5º。
微载体用量为3 g/l的 Cytodex3，接种细胞密度为0.3×106细胞/ml。培养条件为37℃，pH 7.3，5% CO2，采用光纤溶氧电极监测溶氧水平。培养基含有 2% FBS。每小时取样并用结晶紫染色测定总细胞密度，上清中的悬浮细胞和死细胞用台盼蓝染色。MDCK细胞在接种后1 h开始贴附到微载体表面（图 7A）。培养3 h后，85%的接种细胞贴附（图7B）。18 h后，细胞在微载体表面铺展并开始生长（图7C）。
图7.MDCK细胞贴附到微载体的显微照片。培养3 h后，85%的接种细胞贴壁（7B）。18 h后，细胞铺展并开始生长（7C）。
尽管连续混合能够使细胞在微载体上产生更均一的分布，但间歇式、半间歇和连续摇动混合步骤之间没有观察到细胞贴壁和生长的任何显著性差别（图8、9 和10）。在 2% FBS的低血清条件下，不同的混合步骤表现出类似的结果， 且MDCK细胞的贴壁条件具有很好的耐用性。
图 8.间歇式混合方式的 MDCK细胞微载体贴壁情况
图 9. 半间歇混合方式的 MDCK细胞微载体贴壁情况
图 10. 连续混合方式的 MDCK细胞微载体贴壁情况
Vero细胞贴附微载体
我们使用不同的摇动方案和培养基组成研究Vero细胞对Cytodex 3 微载体的贴附。在Cellbag-2L中以600 ml的工作体积进行细胞培养。连续摇动参数被设置为12 rpm和5.5º；以16 rpm和5º间歇摇动2 min；然后设置为0 rpm和0º停止摇动18 min。在6 h 后，上述所有的摇动方式都转为12 rpm和18º的连续摇动模式。图11显示在含血清条件下，连续或间歇摇动混合期间可获得大约90%的细胞贴附。在无血清条件下，间歇式混合方式获得80%贴附，而连续混合获得30%贴附。
图 11.无血清（sf）和含血清（s）培养基对 Vero 细胞贴附到 Cytodex 3微载体的影响。在贴壁阶段，分别采用连续摇动(cont)和间歇摇动(int)的混合方式。接种后24 h 的细胞在微载体上的贴壁情况如图所示。
MDCK细胞的生长和放大（2% FBS）
为了研究在 Cellbag 生物反应器中 MDCK细胞扩增的可放大性，在两种不同大小的袋子之间比较最大细胞密度和细胞生长速率 Cellbag-10 L和 Cellbag-50 L。 袋子的工作培养体积采用最大工作体积的40%（即Cellbag-10 L中为2 L， Cellbag-50 L中为10 L）。
微载体用量为3 g/l的 Cytodex3， 接种细胞密度为0.3×106细胞/ml。MDCK细胞采用摇动速度8 rpm和 5º角度混合。细胞培养期间，在保持角度不变的条件下将摇动速度以阶梯方式逐渐从 8 rpm 提高到 14 rpm。培养温度 37℃，pH 7.4，并监测溶氧水平，细胞培养基中含有2% FBS。
经过最初的延滞期后，细胞终密度达到3×106细胞/ml，和在转瓶(Spinner Flask)中所获得的最大细胞密度类似。 2L和 10L培养体积的细胞生长状况类似，因此显示出良好的可放大性（图12）。
图 12. 对于 2 L和 10 L的培养体积，MDCK细胞的生长状况类似，表明 WAVE良好的可放大性。
Vero细胞在Cytodex 1和Cytodex 3微载体上无血清培养条件下的生长
接种量为4×105细胞/ml 的Vero细胞在含有2 L无血清培养基的Cellbag-10 L中的分别进行Cytodex 1和 Cytodex 3培养。细胞经过间歇摇动混合6 h (16 rpm和4.5º下2 min, 然后0 rpm和 0º 停止摇动18 min)。图13A显示Vero细胞在Cytodex 3上培养6 h 后完全铺展，但是在Cytodex 1上细胞没有铺展开来（图 13 B）。为了提高Vero细胞在 Cytodex 1上的铺展，培养物停止摇动2 h，改进了细胞在Cytodex 1上铺展状况（图13 C）。之后，在 37℃下两种培养物都采用连续摇动的方式继续培养（11 rpm和4.5º）。
Cytodex 1
Cytodex 3
图 13.Vero细胞贴附到微载体后的形态。接种后 6 h和 8 h。
Vero细胞在转瓶 （Spinner Flask)中无血清条件下的微载体培养
Vero细胞也可以在转瓶中进行微载体培养。如图 14 所示，在无血清条件下，WAVE 和转瓶这两种培养系统中可以获得基本相同的最大细胞密度。相比 Cytodex3，Cytodex 1 具有更大的表面积，因而得到更高的细胞密度。Vero细胞在WAVE Bioreactor系统中培养过程中，接种 4天后细胞达到汇合。我们观察到细胞在这两种微载体上生长迅速，无延滞期（图14）；相比转瓶而言，WAVE 反应器中细胞生长速度更快。
图 14. Vero 细胞分别在WAVE Bioreactor 系统和转瓶中采用Cytodex 1和Cytodex 3无血清培养的比较。
图 15显示Vero细胞在Cytodex 1和Cytodex 3上培养4 天后的细胞形态。
透明的 Cytodex 微载体可以不经染色直接镜检，使用台盼蓝染色可以快速观察细胞是否达到交汇（图 16）。活细胞完整的细胞膜将会阻断台盼蓝染料，并阻止微载体被染色。无细胞覆盖的微载体很容易被染色，因此可以方便的看到细胞层中的缺陷或空洞。
图16.WAVE Bioreactor系统内Cytodex 3上汇合的Vero细胞进行台盼蓝染色观察。
结论
本研究发现WAVE Bioreactor系统是一种可以成功用于 Cytodex 微载体培养 MDCK 和 Vero细胞的通用生物反应器。MDCK 和 Vero 细胞具有高的微载体贴壁率。我们发现 WAVE Bioreactor系统和转瓶对于MDCK和Vero细胞的最大细胞密度是相似的， 但WAVE中具有更快的生长速度。对于微载体培养，建议最佳工作体积为最大Cellbag工作体积的20%到80%。
MDCK细胞
· 本研究获得最大细胞密度为3×106细胞/ml，这与使用转瓶在类似的生长条件下所获得
的细胞密度相似。
· 我们使用类似的摇动混合条件，成功的将微载体培养从2 L放大到 10 L培养袋。
Vero细胞
· 我们优化了对 Vero 细胞的接种贴壁操作程序，成功的在无血清条件下获得 80%以上
的细胞贴壁率。
· Vero 细胞在无血清培养基中成功的在Cytodex 1 和 3上进行培养，可以获得均匀的细胞分布，最终细胞在微载体上达到交汇。
· 在无血清条件下，Vero 细胞生长达到最大密度，约为1.4×106细胞/ml，细胞密度与在转瓶中生长的 Vero 细胞相似，WAVE 具有更快的生长速度。