《自然医学》双重磅：CRISPR曝重大漏洞！被成功编辑的细胞或缺失抑癌基因p53，具有潜在致癌能力 | 科学大发现

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本周《自然医学》杂志上又发表了两篇与CRISPR技术相关的论文，暴露了尚未成熟的CRISPR/Cas9技术可能存在的一个关键缺陷！24小时之内，多家CRISPR基因编辑公司股价暴跌10%以上！

这两项研究分别来自瑞典卡洛林斯卡研究所[1]和剑桥诺华生物医学研究院[2]，两个团队分别独立发现，CRISPR/Cas9基因编辑过程中造成的DNA双链断裂，实际上可以激活p53蛋白通路。该蛋白在基因修复过程中有关键作用，一定程度上导致了基因编辑的失败。这也意味着，基因编辑成功的细胞，往往具有p53缺陷——这也是癌细胞中最常见的基因突变！

换句话说，基因编辑成功的细胞很可能是潜在的癌细胞，利用CRISPR/Cas9进行临床治疗可能会无意中增加患癌症的风险！

CRISPR/Cas9可以说是发展得仿佛坐了火箭，这项技术首次走入人们眼帘还是在2012年，但是第一项临床试验去年就已经在中国进行了。技术走得太快，就必然存在一些尚未被发现的缺陷。

CRISPR/Cas9技术在应用过程中有个奇怪的现象，它在转化细胞（例如癌细胞）上编辑效率很高，副作用也很小；但是在治疗疾病方面具有极高潜能的人多能干细胞（hPSC）上，效率却咋也提不起来。与其他细胞类型相比，hPSC的基因修饰效率只有五到二十分之一[3-7]。

面对基因修饰，hPSC简直顽强到底，“宁死不从”[8-13]。

为了找出这其中的关键，剑桥诺华生物医学研究院研究者们开发了一种干细胞系，这种细胞在特定条件下表达Cas9蛋白，只需慢病毒转染gRNA就能实现插入特定基因序列。

这种方法的编辑效率很高，超过80%的细胞都转入了目标序列，但是更惨烈的是，绝大多数细胞都没能熬过这个过程，只有极少数的hPSC存活了下来。

CRISPR/Cas9过后，满地残留着细胞碎片，这个CRISPR/Cas9有毒啊……

基因插入效率是很高，可是细胞也很受伤啊

研究者想到，是不是转入的gRNA种类太多，一次编辑好几个位点细胞受不了呢？以前也有研究显示编辑多个位点是对细胞损伤很大的。于是这次他们固定选择了一种不耽误细胞生存的基因，重复了上述实验，然而结果也是类似的。

对照组的细胞不涉及DNA链的断裂，就能好好生存好好扩增，而接受了基因插入的细胞真是惨烈极了，只有少部分尚能活蹦乱跳，大部分都没能熬过改造。

可见单个位点的DNA双链断裂，就足以对hPSC产生致死的毒性了！

正常的细胞生长曲线和被“毒害”的细胞

为了探究这个过程中的关键分子通路，研究者们对表达变化较大的基因进行了筛选，最终发现最关键的人物竟然是我们都很熟悉的老朋友p53！进一步摸索，下游的通路则是与p21有关。确实，p53本身也在DNA损伤修复过程中起到了很大的作用[14]，对能修复的损伤就修复，修复不了就让细胞自杀。

研究者尝试在细胞系中敲除p53基因，不出所料，p53缺陷的hPSC马上就对基因编辑表示驯服，不再拼死抵抗，生存率大大增加了。另一方面，在两个不同的干细胞系中，敲除p53使基因编辑的效率分别增加了19倍和16倍！

虽然还是有细胞顶不住压力，但是敲除了p53之后明显皮实多了

在另一项研究中，卡洛林斯卡研究所研究者在视网膜色素上皮（RPE）细胞中进行了类似的研究，同样发现CRISPR/Cas9基因编辑导致的DNA双链断裂会激活p53-p21通路，诱导细胞周期的停滞，导致基因编辑的失败。

除此之外，研究者还发现，在DNA双链被成功切断之后，Cas9蛋白还会在切断位点停留6个小时之久[18]，这很可能耽误了正常的DNA损伤修复，加剧了DNA双链断裂带来的影响。

作者之一的Emma Happaniemi在采访中说，“挑选成功完成受损基因修复的细胞，我们很可能无意中挑选到p53缺陷的细胞。”“如果移植到患者体内，比如说在治疗遗传疾病的场景下，这些细胞很可能会引发癌症，导致人们对CRISPR基因治疗安全性的担忧。”[15]

这两篇论文一出，市场为之震动。目前已经走在临床前沿的CRISPR Therapeutics股价暴跌13%——这已经是上周被FDA叫停临床试验之后短期内第二次下跌了——其他基因编辑公司也受到了不小的影响，Editas Therapeutics、Intellia Therapeutics股价均有10%左右的下跌。[16]

CRISPR Therapeutics首席执行官Sam Kulkarni表示，该研究结果可信，虽然研究内容实际并不能覆盖所有的CRISPR使用情景。另一位因利益关系不愿透露姓名的科学家则表示十分担心，很多CRISPR导致的致命缺陷可能“已被错过”。[17]

看起来CRISPR/Cas9和p53之间的矛盾是不可调和的。要么p53不在，细胞有癌变风险；要么p53在，基因编辑失败和细胞自毁二选一。

但是这并不意味着CRISPR技术走进了死胡同。

卡洛林斯卡研究所的生化学家Bernhard Schmierer表示，这些都是十分早期的研究，只是“初步成果”，“目前还不清楚这些发现是否可以影响到临床实际使用的细胞。”此前在实验室中进行的研究，从未发现CRISPR导致的癌症，也一定程度上说明了问题。

而且研究关注点在于CRISPR/Cas9技术，在此之外，还有Cpf1等诸多颇具希望的Cas酶，这些酶是否会出现同样的p53困境还未可知。研究者也认为，如果只是剪除致病基因，而不涉及新基因的插入的话，p53是不会被“调动"的.

再说了，这个问题并不是完全没有办法解决。在现有的技术条件下，我们可以对编辑前后的细胞进行测序，监控p53功能，规避风险。

研究者们正在努力寻找p53通路的详细作用过程，如果可以在基因编辑过程中让p53暂时歇一歇，那岂不是美哉？而且在某些情况下，我们还有不需切断DNA的单碱基编辑技术，还是大有可为滴。

来自肯特大学的遗传学家Darren Griffin教授有句话说得很好，“几乎任何能够带来益处的治疗方法，都有能力造成伤害，这些发现应当被放在更大的背景中去思考。” [19]

技术前行总会遇到瓶颈，而每一次挫折都将使让我们更加强大。

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参考资料：

[1] https://www.nature.com/articles/s41591-018-0049-z

[2] https://www.nature.com/articles/s41591-018-0050-6

[3]Mali, P. et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339,823–826 (2013).

[4]Hsu, P. D. et al. DNA targeting specifcity of RNA-guided Cas9 nucleases.Nat. Biotechnol. 31, 827–832 (2013).

[5]He, X. et al. Knock-in of large reporter genes in human cells via CRISPR/Cas9-induced homology-dependent and independent DNA repair. Nucleic Acids Res. 44, e85 (2016).

[6] Lombardo, A. et al. Gene editing in human stem cells using zinc fnger nucleases and integrase-defective lentiviral vector delivery. Nat. Biotechnol.25, 1298–1306 (2007).

[7]Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K. & Doudna, J. A. Enhanced homologydirected human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife 3, e04766 (2014).

[8] Zwaka, T. P. & Tomson, J. A. Homologous recombination in human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 21, 319–321 (2003).

[9] Hockemeyer, D. et al. Efcient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-fnger nucleases. Nat. Biotechnol. 27,851–857 (2009).

[10]Liu, Y. & Rao, M. Gene targeting in human pluripotent stem cells. Methods Mol. Biol. 767, 355–367 (2011).

[11] Hockemeyer, D. & Jaenisch, R. Induced pluripotent stem cells meet genome editing. Cell Stem Cell 18, 573–586 (2016).

[12] Song, H., Chung, S. K. & Xu, Y. Modeling disease in human ESCs using an efcient BAC-based homologous recombination system. Cell Stem Cell 6,80–89 (2010).

[13] Merkle, F. T. et al. Efcient CRISPR-Cas9-mediated generation of knockin human pluripotent stem cells lacking undesired mutations at the targeted locus. Cell Rep. 11, 875–883 (2015).

[14] Lane, D. P. p53, Guardian of the genome. Nature 358, 15–16 (1992).

[15]https://ki.se/en/news/genome-editing-tool-could-increase-cancer-risk

[16]https://www.cnbc.com/2018/06/11/crispr-stocks-tank-after-research-shows-edited-cells-might-cause-cancer.html

[17]https://www.statnews.com/2018/06/11/crispr-hurdle-edited-cells-might-cause-cancer/

[18]Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L. & Corn, J. E. Nat.Biotechnol. 34, 339–344 (2016).

[19]http://home.bt.com/news/science-news/precision-gene-editing-tool-could-increase-cancer-risk-in-patients-11364277357571

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作者 | 代丝雨

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