寡核苷酸几乎全部使用核苷亚磷酰胺方法合成,目前限于约200聚体的直接合成并产生危险废物。科学家们描述了使用模板非依赖性聚合酶末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的寡核苷酸合成策略。
每个TdT分子与单个可掺入引物的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)分子偶联。 结合dNTP后,引物的3'末端保持与TdT共价结合并且不能与其他TdT-dNTP分子接触。 切割TdT和掺入的核苷酸之间的连接释放引物并允许随后的延伸。 这篇文章证明TdT-dNTP结合物可以在10-20s内通过单个核苷酸定量延伸引物,并且该方案可以被迭代以写出确定的序列。 该方法可以形成酶促寡核苷酸合成仪的基础。
绝大多数生物研究和生物工程需要合成DNA,包括寡核苷酸(寡核苷酸)和较长的构建,如合成基因,甚至整个染色体。大规模平行寡核苷酸合成大大降低了高通量和全基因组功能筛选的成本以及下一代测序(NGS)目标捕获的成本。从头合成DNA也使其他新兴应用如DNA纳米技术和基于DNA的数据归档成为可能。
今天,基本上所有的合成DNA都是使用Marvin Caruthers及其同事超过35年前开创的核苷亚磷酰胺方法生产 - 这是一个标志着生物学研究拐点的发展。然而,经过数十年的液体处理的微调和改进之后,实践中亚磷酰胺基寡核苷酸合成的上限现在约为200-300 nt。因此,更长的分子必须从寡聚体组装而成,这种过程易于失败并且不适合所有靶序列,从而导致某些DNA序列无法进入研究。
具有限定序列顺序的寡核苷酸的酶从头合成的研究至少返回到1962年。酶合成寡核苷酸合成比化学合成有以下几个潜在优点:1)酶的精确特异性和它们发挥作用的温和条件可以减少副产物的形成和脱嘌呤等DNA损伤,从而能够直接合成更长的寡核苷酸; 2)反应发生在含水条件下,不需要产生危险废物; 3)可以从天然DNA(即,在碱基的亲核位置上没有保护基团的DNA)开始合成;和4)酶工程技术,例如高通量筛选和选择可用于以仅使用有机化学不可能的方式优化系统。
末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)是唯一已知的特殊聚合酶,其主要活性是将脱氧核苷酸三磷酸(dNTPs)不加选择地添加到单链DNA的3'末端,使其成为用于酶促寡核苷酸合成的天然候选物。然而,迄今为止还没有关于基于TdT的实际寡核苷酸合成方法的证明。
科学家们开发了一种可逆终止的方法,其中每个聚合酶分子用连接的三磷酸核苷进行位点特异性标记 。当聚合酶将其连接的dNTP掺入引物中时,它保持与3'末端共价连接,阻止其他聚合酶-dNTP缀合物的进一步延伸。然后可以切割接头以使引物的3'末端去保护用于随后的延伸。这个简单的两步反应循环的扩展和去保护可以迭代写出一个定义的序列。