【基础研究】Tag Array基因芯片快速诊断抗结核药物耐药的可行性研究

文章来源：中华骨科杂志, 2018,38(2) : 110-119

作者：武文杰 程鹏 张泽华 罗飞 许建中 

材料与方法

一、主要仪器与试剂

BACTEC MGIT 960分枝杆菌液体培养系统（Becton Dickinson，美国）、晶芯^®LuxScanTM 10K-B微阵列芯片扫描仪（北京博奥生物有限公司，中国）、晶芯^® ExtractorTM 36核酸快速提取仪（北京博奥生物有限公司，中国）、E-CyclerTM 96 PCR扩增仪（北京博奥生物有限公司，中国）、HybSet基因微阵列芯片杂交盒（北京博奥生物有限公司，中国）、Thermo高速离心机ST16R（Thermo Fisher Scientific，美国）、晶芯^®SlidewasherTM芯片洗干仪（北京博奥生物有限公司，中国）、晶芯^®BioMixerTM II芯片杂交仪（北京博奥生物有限公司，中国）、晶芯^®结核分枝杆菌耐药检测芯片判别系统（北京博奥生物有限公司，中国）、1200TE生物安全柜（上海力申科学仪器公司，中国）、XW-80A漩涡混合器（上海青浦沪西仪器厂，中国）。

芯片清洗缓冲液20×SSC（441050，北京博奥生物有限公司，中国）、质量分数为10%的芯片清洗缓冲液SDS（441060，北京博奥生物有限公司，中国）、NaOH溶液（10 mol/L和0.1 mol/L，北京博奥生物有限公司，中国）、核酸提取液（100 μl∶5 mg/ml溶菌酶，2 mg/ml蛋白酶K，1% SDS，乙酸钾，石炭酸/三氯甲烷/异戊醇25∶24∶1，北京博奥生物有限公司，中国）、扩增PCR试剂（24 000 μl ω-3多不饱和脂肪酸和多种维生素制剂5×buffer，10 560μl 25 mmol/L MgCl₂，12 000 μl 2 mmol/L Dntp/Dutp，2 400μl BSA，1 800μl Promega热启动酶，120μl UNG酶，北京博奥生物有限公司，中国）、杂交液30ml（13 500μl 20×SSC，4 500 μl50×Denhardt's，11 250 μl 100%甲酰胺，450 μl 10%SDS，北京博奥生物有限公司，中国）。

二、芯片设计

通过结核耐药相关基因突变数据库（tuberculosis drug resistance mutation database，TBDReaMDB）查阅利福平、异烟肼、乙胺丁醇酮类、氟喹诺酮类、氨基糖苷类及环肽类等药物的常见耐药基因、突变位点以及突变位点的覆盖率，选取覆盖相对较广的突变位点（利福平：rpoB；异烟肼：katG，inhA，oa；链霉素：rpsL，rrs；乙胺丁醇：embB；氟喹诺酮类：gyrA；氨基糖苷类及环肽类：阿米卡星、卡那霉素和卷曲霉素：rrs），通过微量点样技术将质控探针和各位点的目标检测探针固定到基片上。基本工作原理见图1。每个检测区呈11行×12列分布（表1）。排布说明见表2，探针序列见表3。

图1 基本工作原理示意图。用带有Tag标签序列的基因位点特异性引物对相关基因位点所在基因片段进行扩增和荧光标记，然后与能够识别相应标签序列的通用基因芯片进行杂交，最后通过对芯片进行扫描和数据分析就可以得到所检测的突变位点的检测结果

三、检测流程

使用无菌接种环选择固体培养基上任意一个肉眼可见的菌落，置于含核酸提取液的核酸提取管中，并进行编号。使用Extractor 36核酸快速提取仪振荡5 min，95 ℃水浴5 min，5 000 rpm离心1 min，得到的核酸放置于-20 ℃暂存。采用核酸检测试剂盒（PCR荧光探针法）对提取的质粒进行定量处理，根据质粒浓度对样品进行稀释或浓缩后分组，使质粒浓度在1×10²拷贝/μl、1×10³拷贝/μl、1×10⁴拷贝/μl、1×10⁵拷贝/μl、5×10⁵拷贝/μl、1×10⁶拷贝/μl。从试剂盒中取出PCR扩增试剂1~8，对每个样品进行8管PCR扩增反应。离心后，在管中分别加入25 μl PCR扩增试剂及质粒DNA，进行PCR扩增反应。

（一）产物纯化过程

取200 μl离心管，加入10 μl缓冲液，再加入磁珠10 μl，混匀后吸附15秒，用磁力架去除溶液后再加入40 μl缓冲液。每份检测需用两个离心管（1号管和2号管）；在1号管中加入1、2、3和4体系PCR产物各10 μl；在2号管中加入5、6、7和8体系的PCR产物各10 μl（表4）。分别向两个管中加入磁珠悬液各40 μl，混匀后静置10 min。将产物-磁珠混合物置于磁力架上，吸附15 s，然后向两管中分别加入新配制的0.1 mol/L NaOH 60 μl，充分混匀，静置10 min后吸附15 s。向上述离心管中加入杂交缓冲液40 μl，吸附15 s，再加入杂交缓冲液20 μl，充分混匀，准备杂交。

（二）芯片杂交

将约200 ml纯化液注入芯片杂交盒，每个微阵列限一个杂交混合物，将杂交混合物（约15.5 ml）注入芯片，密封放入杂交仪，计时1 h进行杂交。然后在晶芯^®Slidewasher^TM芯片洗干仪中进行芯片洗涤与干燥。使用LuxScan 10K-B微阵列芯片扫描仪进行信号的读取，根据图片结果与芯片设计图对比，进行人工判读从而得出结果。

采用标准方法进行传统培养+药敏试验，8种测定药物及其界限浓度^[11,12]：利福平（50~250 μg/ml）、异烟肼（1~10 μg/ml）、乙胺丁醇（5~50 μg/ml）、喹诺酮类药物（5~50 μg/ml）、链霉素（10~100 μg/ml）、卡那霉素（10~100 μg/ml）、卷曲霉素（10~100 μg/ml）、阿米卡星(10~100 μg/ml)。

将芯片检测结果与前期测序结果对比，评估其基因检测的准确性。然后，将芯片检测结果与结核菌培养和绝对浓度法药敏检测结果对比，分析芯片的敏感度和特异性。

结果

一、芯片扫描结果

当质粒浓度在1×10³~1×10⁶拷贝/μl时，相应检测探针位点均能表现出阳性荧光信号，当质粒浓度<1×10³拷贝/μl时，大部分则无法显示出阳性荧光信号，呈现出假阴性结果。芯片结果与样本测序结果对相，当质粒浓度在1×10³~1×10⁶拷贝/μl时，显示出的突变位点与测序显示的突变位点相同（图2）。

图2 gbTAG273探针杂交结果　A　质粒浓度为1×10²拷贝/μl，与测序结果比较，在相应的突变位点，未观察到对应的荧光　B　质粒浓度为1×10³拷贝/μl，与测序结果比较突变位点在芯片对应位置出现绿色荧光，显示芯片扫描结果与测序结果吻合　C　质粒浓度为1×10⁴拷贝/μl，与测序结果比较，突变位点在芯片对应位置出现绿色荧光，显示芯片扫描结果与测序结果吻合　D　质粒浓度为1×10⁵拷贝/μl，与测序结果比较，突变位点在芯片对应位置出现绿色荧光，显示芯片扫描结果与测序结果吻合　E　质粒浓度为1×10⁶拷贝/μl，与测序结果比较，突变位点在芯片对应位置出现绿色荧光，显示芯片扫描结果与测序结果吻合

二、芯片检测耐药结核的敏感度与特异性

126株利福平表型耐药株中，芯片检测出119株在rpoB基因出现突变；在表型敏感株中，9株rpoB基因耐药位点突变。突变频率最高的为rpoB531（78株）占63.93%，其中有11株在rpoB基因出现多个位点突变。

118株异烟肼表型耐药株中，芯片检测出109株耐药株突变；在表型敏感株中，有13株检测出基因突变。突变频率最高为KatG315（105株）占86.07%，其中有21株在KatG315和inhA-15上均有突变，但未发现oxyR-ahpC合并其他基因位点突变的菌株。

44株乙胺丁醇表型耐药株中，芯片检测出27株在embB306位点上有突变；在表型敏感株中，有6株检测到突变。

102株喹诺酮类药物表型耐药株中，芯片检测出81株在gyrA基因上有突变；在敏感株中4株检测到该基因发生突变。gyrA94突变率最高（55株，66.27%）。

112株链霉素表型耐药株中，芯片检测出101株有突变；在表型敏感株中，有12株检测出突变。突变频率最高的为rpsL 43（91株）占79.82%（图3）。

图3 探针杂交结果　红色方框内显示相应位点的突变得出对应的突变结果　A　rrs1401突变型探针　B　rpoB522突变型探针　C　katG315突变型探针　D　rpoB526突变型探针　E　inhA-15突变型探针　F　rpoB531突变型探针

由于阿米卡星、卷曲霉素、卡那霉素具有交叉耐药性，故将此结果合并统计。在67株表型耐药株中，芯片检测出52株存在突变；在表型敏感株中，有11株检测出突变，rrs1401区域突变频率占98.41%（图4，表4）。

图4 探针杂交结果　红色方框内显示相应位点的突变得出对应的突变结果　A　rpsL43突变型探针　B　katG315突变型探针　C　rpsL88突变型探针　D　embB306突变型探针　E　rpoB511突变型探针　F　rpoB516突变型探针

讨论

一、芯片检测耐药结核的临床可行性

Tag Array芯片进行结核耐药检测，理论耗时约6小时，对于临床上进行结核快速诊断，早期制定个体化治疗具有重要意义。本实验将已知质粒作为模板，用不同浓度梯度的模板进行PCR扩增后，与芯片杂交。结果显示：质粒浓度>1×10³拷贝/μl的组均能显示其位点的杂交信号，并与测序结果一致，正确率达到100%。这证明该芯片系统在其检测的灵敏度范围以内，具有极高的可靠性。Warren等^[13]报告临床上获取样本进行抗酸染色涂片，其浓度至少要求达到每毫升含5000~10000个结核分支杆菌才能进行有效检测。因此，如果检测对象为抗酸染色阳性的样本，那么1 ml至少可以提取5000拷贝的质粒，只需获取0.25 ml进行质粒提取就能满足1×10³拷贝/μl的最低质粒浓度要求。这意味着本芯片检测系统可对抗酸染色涂片阳性的结核样本进行直接耐药检测。

从骨关节结核患者的脓肿及干酪样坏死组织中获取的样本往往因细菌浓度较低而呈阴性。在这种情况下，可以在获取更大样本量的情况下进行质粒提取，进行早期芯片耐药检测。对临床诊断为结核的患者，如果芯片耐药检测为阴性，我们建议将样本进行结核杆菌培养2~4周^[14,15]，再用芯片检测，这样可达到早期检测的目的，与传统培养后再用绝对浓度法进行药敏检测所需要的6~8周时间相比较，仍有一定优势。

Tag Array芯片可同时检测22个突变位点共计38个突变类型，一次性可对RFP、INH、EMB、SM、SLID（AMK/CPM/KM）、FQS等药物进行耐药检测，这对于基于PCR技术的耐药检测有明显的优势。同时，该芯片为可视化芯片，在紧急或极端情况下，无需使用扫描仪进行扫描，专业人员可用肉眼直接判读结果，降低了实验条件门槛，在突发疫情或需要移动诊疗检测时，提供便利。

二、芯片诊断一、二线抗结核药物的敏感度和特异性

本芯片可对rpoB基因的7个位点共计14个突变型进行检测，同类产品中，GenoType_ MTBDRplu可检测4个突变型^[16]，CapitalBio™可检测6个突变位点，文献报道在利福平耐药结核杆菌中rpoB基因突变率为96%~100%^[17,18]，且有部分结核杆菌虽然有rpoB基因突变，但是临床表型未发现耐药。高突变频率位点发生在rpoB531、rpoB526位点^[19]，这与我们的实验相吻合。检测利福平敏感度为94.40%；特异度为86.76%，这与一代结核耐药芯片CapitalBio™及国外产品的结果较为接近^[6,7,8,9]，与表型结果一致性较高。

异烟肼耐药机制仍被认为是一种遗传进化。目前认为katG和inhA和ahpC基因突变与异烟肼耐药密切相关^[20,21]，相关基因的突变在异烟肼耐药中敏感性接近100%^[22,23]，但有的学者认为异烟肼耐药基因的突变率和地域有关，因此会影响相关基因耐药位点检测的敏感性^[24,25]。我国报道异烟肼耐药中，katG突变占36.8%（katG315突变率最高），inhA占32.8%，oxyR-ahpC占6.9%^[25]。本次检测敏感度为92.37%；特异性为81.16%，其敏感度与特异度的差异应和所取样本量有关。

乙胺丁醇是一种在标准化治疗中替代链霉素，与异烟肼、利福平、吡嗪酰胺连用的药物。其耐药率低于链霉素^[26]。早期的研究报告显示，embB基因，特别是密码子embB306突变是引起乙胺丁醇耐药的主要机制，另外还包括319、354、406等突变位点^[27]。有报道分子诊断手段检测乙胺丁醇耐药性的灵敏度为60%~80%，特异性为93%~100%^[28,29]，本实验检测结果与文献报道数据较一致。根据以上数据分析可知，如果芯片出现阳性结果，则乙胺丁醇表型耐药可能性非常大；但芯片阴性结果参考意义不大，这在用于快速诊断时，假阴性结果应及时调整用药方案。

链霉素在我国耐药突变非常高，主要是因为链霉素早期作为一线抗结核药物在我国应用多年，耐药变位点多位于rpsL43、rpsL88、rrs531、rrs516^[30]。TBDReaMDB数据库显示，此4位点突变共覆盖了85%的耐链霉素结核，其中rpsL43（72%）、rpsL88（5%）、rrs531（7%）、rrs516（1%）。本芯片检测敏感度为90.17%，特异性为84.00%，仍具有较高的临床参考价值。

喹诺酮类药物是常用的抗结核二线药物，gyrA耐药决定区发生突变会导致不同水平的喹诺酮类药物耐药^[31]。最常见的是gyrA94和gyrA90位点突变。一些研究通过线性探针分析、焦磷酸测序，或Sanger测序进行氟喹诺酮类耐药检测，得到其灵敏度平均约为80%、特异度接近100%^[32,33]。丁胺卡那霉素、阿米卡星和卷曲霉素在rrs1400区域突变存在交叉耐药，突变率最高分别位于1401、1402、1484位点^[34,35,36]。rrsA1401G突变可导致60%的卡那霉素、75%的卷曲霉素和阿米卡星耐药，并认为此位点应突变作为这三种药物的耐药标记^[37]。在测序检测时，因无法做到精确评估KAN、AMK和CAP分别的耐药情况，而且rrs1400区域发生突变后交叉耐药发生率极高，所以如发生此区域常见位点突变，只能判定此三种药物均耐药，在制定化疗方案时将它们排除。因此，本次实验中只要表型耐药包含其中一种抗生素，就认为对此类药物（SLID）耐药，这对于临床化疗方案的制定来说，虽然缩小了可能的抗结核药物应用，但更大程度上避免了无效化疗，除在广泛耐药无药可选的极端情况外，此设计能提高早期化疗的有效性。国外报道，GenoType MTBDRsl assay检测的敏感度为86.4%，特异度为90.1%^[37]。而我们的结果为，敏感度：77.61%，特异性为87.50%，与GenoType MTBDRsl assay比较，敏感度较低，考虑可能与该芯片未检测eis启动子区有关。

通过Tag Array结核耐药基因检测芯片可实现骨关节结核耐药快速、准确、高通量检测，具有重要的临床意义及可行性。下一步还需进行双盲、大样本临床标本检测的对比研究，更进一步对芯片检测的特异度和敏感度进行分析，以对其实际应用情况进行研究、分析和评估。

 参考文献（略）