合成生物学领域前沿技术

一、 近五年国内新理论、新原理、新观点、新方法、新成果、新技术

合成生物学的发展很大程度上依赖人们对生命体内在运动规律的掌握，近年来国内的一些研究发现为有目的地改造生命体提供了理论基础。

1基因组复制工程辅助的连续进化

2013年，李寅等提出了基于基因组复制工程的连续进化（Genome replication Engineering assisted continuous evolution，GREACE）概念。其原理是通过在微生物细胞中引入一系列经遗传修饰的DNA 聚合酶校正元件使细胞进入一种高突变率的状态，从而在筛选压力条件下加速进化过程。经过一段时间的进化后，将校正元件从细胞中移除，这时细胞能维持稳定的基因型，同时能将这种优势表型遗传下去。这为解决在从头合成基因组中表达异源蛋白时所面对的一些问题提供了有效的解决方法。

2microRNA定量调控

2015年，清华大学自动化系、清华信息国家实验室生物信息学研究部/合成与系统生物学中心汪小我和谢震研究组揭示了microRNA定量调控规律，发现microRNA的靶位点结合能力对竞争性内源RNA（ceRNA）效应强度影响的函数关系，并阐述了microRNA通路和RNAi通路竞争效应的不对称性。该研究为合理的设计有效的RNAi实验来减少siRNA的脱靶效应提供了理论基础，为未来用RNAi技术有效设计疾病基因靶向治疗等提供了理论基础。

3定制特定大小的细菌细胞

2016年，中科院深圳先进技术研究院合成生物学工程研究中心研究员刘陈立团队发现细胞通过控制DNA复制的起始来协调细胞个体的大小，二者之间的关系可以用一个简单的数学公式来描述，该公式具有广泛的适用性。基于该定律，结合定量调控特定蛋白表达水平的基因回路，人们可以根据实际需求轻松设计并建造出特定长宽的细菌细胞。该研究对实现创造生命这一目标有着积极的意义。定向改造基因组序列为我们解决其中的某些问题提供了新的思路。

4活病毒疫苗

2016年，北京大学医学部周德敏等研究人员利用琥珀密码子（终止密码子）可以识别非天然氨基酸的原理，通过将病毒复制基因的某个或部分编码密码子突变成终止密码子，使其在感染人体细胞后，不能进行完整的蛋白质翻译，从而获得了活病毒疫苗。所获得的病毒疫苗具有安全性和有效性。并且进一步突变三个以上三联码，病毒还由预防性疫苗变为治疗病毒感染的药物，且随着三联码数目的增加而药效增强。这一发现颠覆了病毒疫苗研发的理念，成就了活病毒疫苗的重大突破。

二、近几年我国在DNA组装技术方面的研究也有突破性的成果

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CATCH技术：

2015年，清华大学的朱听课题组在Nature Communications杂志在线发表了题为CATCH enables one-step targeted cloning of large gene clusters的论文，他们首次体外应用Cas9系统实现对上百kb的基因组片段的靶向克隆。利用体外转录制备的sgRNA和表达纯化的Cas9蛋白特异性酶切目标全基因组，并通过Gibson Assembly原理将长达100 kb的目标片段一步连接到细菌人工染色体上实现特异性克隆。该技术的开发将极大简化对能够表达具有高附加值生物大分子的基因簇的克隆步骤，节省时间并降低成本。

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C-Brick 技术：

2016年，中国科学院上海生命科学研究院的赵国屏课题组利用 CRISPR 相关蛋白 Cpf1开发C-Brick 体外DNA拼接技术。Cpf1 可以由人工设计的 crRNA 特异性引导切割 DNA并形成 5’突出的粘性末端，通过类似 BioBrick的前后缀设计思路，从而实现 DNA 元件的标准化拼接。C-Brick技术从根本上解决了以下两个问题：(1) 所用酶识别位点不能分布的太广泛；(2) 所产生的scar不能太长，不能编码稀有密码子，不能编码极性太强的氨基酸（造成融合蛋白不可溶）。利用C-Brick，赵国屏课题组已成功地拼接了多个荧光基因，进一步促进DNA组装技术的发展。

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CasHRA技术：

2016年，中国科学院上海生命科学研究院覃重军团队开发了CasHRA (Cas9-facilitated Homologous Recombination Assembly) 技术。利用酵母原生质体融合，结合 Cas9 在体内切割释放出待拼接的 DNA 片段，然后利用酵母体内重组系统将片段拼接，最后得到 1.03 M 的MGE-syn1.0 最小大肠杆菌基因组，首次实现兆（M）级别的基因片段的靶向克隆，为合成生物学的进一步发展提供了潜在的研究框架。

这些DNA 组装新技术的不断发展，无论是在尺度上还是效率上，均有了质的飞跃，使得DNA组装技术更简便、高效，且进一步促进了更大更复杂DNA片段组装技术的发展。

三、我国合成生物学发展水平、战略需求及研究方向

由于合成生物学需要基于系统生物学所发现的生命体的运动规律来设计或者改造一个生命体，因此合成生物学的发展瓶颈主要在于系统生物学。今后生物学家面临的关键问题将不再是如何通过分子生物学操作来创建新的菌株，而是如何通过模拟分析确定怎样的序列才能使形成的新生命体具有期望的功能。太强调“生物元件”很难找出有普适意义的人工系统，因此我国在开展合成生物学研究时应该走出思维困境，转变科学研究的方式、规范以及战略。

由此可见，我国合成生物学的发展正在逐步追赶发达国家，并形成一套符合我国国情的、具有现实意义导向的，并且能够引领全球合成生物学发展的模式。由于合成生物学应用领域广泛、实用价值高，我国对其发展应保持支持和鼓励的方针，倡导和加强国防、医疗、环境、材料、经济、能源、食品和农业等领域对合成生物学的学习认识。

附：浅谈太空合成生物学

      自合成生物学诞生以来，一直存在一个相当边缘的“神秘”分支：空间合成生物学。这个学科虽然年轻，但是却有着深厚的研究基础；这个领域虽然小众，但是却被航天人士寄予厚望；这个研究方向虽然距离应用还很远，但国际范围内已有科研团队率先踏上了征途。我国近年来也在积极发展航天事业，取得了诸多亮眼成果。然而空间合成生物学对于中国民众，乃至中国合成生物学界都还相当陌生。

      通过对地球生命进行工程化改造，进而应用于人类的宇宙探索：生物传感器在航天器上应用、参与生命支持系统构建、在地外行星上开采矿物、改造目标星球环境、在外太空生产药品以支持长期载人航天任务等等，这些科幻作品中才会出现的场景也许离我们并不遥远。

    正值中国第一个空间实验室天宫二号发射升空之际，我们关注空间合成生物学。蓝晶实验室邀请到清华大学博士研究生王宣撰文，从他的视角为诸位读者解读空间合成生物学的方方面面。

太空合成生物学的兴起

2014年，iGEM竞赛取消分区赛，我带领首次参赛的北京师范大学iGEM团队奔赴波士顿。在会场，我遇见了不少好的合成生物学的想法和项目。其中一个令人印象深刻的团队是Stanford-Brown-Spelman iGEM团队。这支队伍不但项目展示过程十分流畅，而且其项目与火星探索相关。这引起了我的兴趣。

     项目的内容是制造轻便无人机，利用没有活性的真菌菌丝作为主体，让工程菌在模具中生长后生产可降解的醋酸纤维素作为填充材料，在加上能够探测各种生境指标的工程菌来进行火星探索。尽管看起来脱离了探索火星这个名词项目依然成立；但是放眼这只队伍前后几年的项目，均与太空探索相关。这也不禁勾起了我的思考，如果通过实用主义的观点来看，合成生物学的技术应用到火星探索上困难重重，除了完成项目参加比赛，可能就是没有用处。打开这只队伍的wiki，发现他们的指导团队来自美国宇航局NASA的Ames Research Center(ARC)。2010年，ARC就开始了太空合成生物学（Space Synbio）的项目。

2014 Stanford-Brown-Spelman iGEM team 火星无人飞机样品 Figure from http://iGEM.org

   什么是太空合成生物学？在合成生物学的定义还不太清晰的时候，我们是否有必要去探讨太空合成生物学的含义？那么我们不妨看看ARC对它的阐述，太空合成生物学的任务是：提供可靠的生物工具和技术来维持在太空中的人类活动，减少太空探索的风险，推动一些假说驱动的研究（即我们从哪里来？我们将去向何方？我们是独一无二的吗？）。而与太空合成生物学相关的领域则在这些方面：原位（in situ）的资源开发、基于生物膜的过滤器、用于先进制造的生物基材料、生物3D打印、生物采矿、生产纯化需要的药物、生产食物、生命支持以及开发检测工具等。

    太空合成生物学作为航空航天工程和合成生物学的交叉，将会吸收两个领域的特质，得到蓬勃发展；并且反过来极大地促进合成生物学和航空航天工程的发展。

     当美国总统Jack Kennedy于1961年鼓动美国国会和国民支持10年之内登上月球这种伟大的计划时，我们对月球可以说还一无所知。然而仅仅过了8年，1969年7月20日，“阿波罗II号”登月舱成功降落在月球上，Neil Armstrong跨出登月舱，踩在了月球上，成为人类历史上一个新的里程碑。当我们回顾航空工程历史时，Ernst Stuhlinger曾经说过“旅月飞行器任何一个部件的制造对技术的精准度和可靠度要求之高在整个工程学的发展史上都是前所未见的。为了满足这严苛的技术要求，我们不断发展整个科学体系，与此同时，我们更寻找新材料新方法、革新技术体系、完善制造工序、延长仪器寿命、乃至发现新的自然规律。”事实上，每年大约有上千项始于太空任务的技术发明进入我们的生活中，例如更好的餐具、收音机以及其他日常工具，先进的垃圾处理系统和医学仪器。极具挑战性的目标，是能够给予人强大的动力进行创新性研究，激发人们的想象力，太空合成生物学将成为一个催化剂，为合成生物学和航空航天事业的发展掀起连锁反应。也许在将来的某一天，人工合成一个生命体将变得非常容易，那么基因作为信息，将能够非常容易运输和在探索的星球重新创造出生命体。

阿波罗计划中大量新研发技术转入民用极大促进了人类文明进步

太空合成生物学面临的挑战

    太空探索需要交通、居住地、生命维持系统、电力、热能、光能和辐射预测等等，面临的挑战在于多任务下的成本、容积、灵活性以及可实现的可能性。合成生物学的平台能够保证探索过程更加可靠：因为生物平台具有自复制的功能和灵活的产食物、材料和特殊化合物的能力。

   然而在太空中，当重力为0的时候，我们如何运转生物反应器？太空辐射对于微生物将有什么伤害？

   对此，加州大学伯克利分校的Adam P. Arkin总结出了空间合成生物面临的六个方面的巨大挑战：

1.资源利用

1.1.确保生物在极端环境中仍然有功能。

1.2.能够提供处理三种资源的能力：废物，气体和矿产。

例如Michael Flynn和John Hogan提出利用尿液中固体成分来生产各类物质：将脂肪族化合物转化成二甲胺用于清洁、将糖类转化成葡萄糖酸、半乳糖等等用于食用。如果按照每个宇航员每天59g尿液固体废物，其中有1.5%是可以回收利用产来计算，当5个宇航员执行3年的任务，将会有4.5kg有价值的的生物合成产品。例如Mark Blenner提出将人类的脂类代谢物用于PHA的生产，最终用于3D材料的打印。

1.3.提供工业生产原料和用于建造的生物材料。例如广泛使用的由生物合成的PHA材料将会是容易获得的材料，而性能是否能够使用太空的高辐射环境还需要进一步测试。

2.工业生产

2.1.和黏合剂一起满足建造相关的需求，用于结合表皮土层，生物水泥和生物高分子。

2.2.提供电力和飞船推动力的燃料。例如NASA ARC和 JCVI合作开发了微生物燃料电池用于污水处理和产电。

2.3.回顾非生物制造业和建造技术来发挥现有的或者合成生物学的应用潜力。

3.生命支持

3.1.提升对废物，尤其是废水的生物维护方法。

3.2.通过将生物包含进入传统的无生命结构来处理、控制和回收空气、水和固体废物。例如：创造一个“活着的”生境。

3.3.生产美味，营养，有质感的食物。

3.4.提供营养物质，并协助回收营养。

4.空间药物和人类健康

4.1.防止疾病和维持人类微生物组。

4.2.制造合成药物抵抗疾病、辐射损伤和重力减弱。

4.3.发展防辐射、自我修复的防护服和装置。

5.空间控制论

5.1.发展器件级别的（device-level）控制系统：完全的或者部分整合的生物原件。

5.2.设计一种人造生命：完全或者部分整的生物原件组成，或者有非生物传感器和制动器并部分整合的生物控制器和系统。

6.外星环境地球化

6.1.通过几种多功能的物种，完成碳和氮循环，使得外星环境地球化接近完成。

太空合成生物学的发展三部曲

    在火星或者其他行星上建立人类的文明是科幻小说经久不衰的题材。Kim Stanley Robinson的火星三部曲将人类前往火星的殖民过程分为三个阶段：于2026年第一次前往火星开始火星地球化的红火星阶段；来自地球的植物开始生长的绿火星阶段以及当气压和温度增加导致液态水在火星表面汇聚成河流的蓝火星阶段。我也将从三个阶段来介绍太空合成生物学可能的应用前景。

红火星：航空生命维持系统的建立

从人类第一枚火箭发射开始，载人航空最远也仅仅是到达月球，从1968年上映的《2001太空漫游》迄今，电影中的大部分设想都实现了，唯独差了太空漫游这一项。设计去月球和去火星甚至更远地方的旅行计划有很大的不同。如果仅仅是执行短期的任务，或者在国际空间站待上一年，宇航员是很容易获得各种补给：包括食物、水以及氧气发生装置以及容易送回废物，即只需要开环系统（open loop system）的生命维持系统即可；而往返火星最少需要花费三年：6个月时间前往火星，在火星地面待2年再6个月回来，很难带上所需要的所有空气、食物和水。显然这些物质需要尽可能地再循环利用。

载人航空的边界 Figure from NASA ARC

生命维持系统的主要功能需要有空气循环系统，水循环系统，温度和湿度控制系统，废物处理和储存系统，应急管理系统等。

对于人类过去半个多世纪开始的航天探索，整个系统基本是不可再生的，也就是开环的系统（Open Loop System）。

在初期以及现在的航空任务中，人类并不会在太空中待太长时间，少则几百分钟，多则达到几十天，因此对系统要求就是尽可能简单可靠。因此食物等资源完全是由宇航飞船或者货运火箭从地球运送，航天使用过的水和废弃材料被压缩打包带回地球或者将液体喷射出飞船。即使目前最先进的生命维持系统国际空间站（International Space Station）也只能够做到部分闭环的系统（Close Loop System）,循环氧气和控制压力。

国际空间站生命维持系统中各物质的相互作用 Figure from wikipedia

宇航员的物质消耗达到11吨/年，而航天器运送1kg物资就要花费10000美金。现有的生命维持系统难以支撑到火星。Figure from NASA Technical Reports Server(NTRS)

事实上，影片中最准确的是马克在居住舱内将环境地球化，用人类粪便，火星土壤和火箭筒爆炸产生出的水种植土豆，整个居住舱成为了马克的生命维持系统。而整个求生的故事反映了宇航员生命维持系统的核心思想——循环利用一切可以循环的东西。

当前，人类太空探索的疆域不断拓展，从近地轨道到深空探测，从登陆月球到火星生存（未来式）；人类要飞出地球、进行科幻小说中的星际旅行，首要任务就是维持一个可靠的生命维持系统，使得人类能够在里面生存。

   在未来我们探索火星的不同阶段，面临的风险是不同的，对太空合成生物学（空间合成生物学）的诉求也是不同的。

    事实上，美国、日本、俄罗斯、欧洲以及中国都曾今或正在进行生命维持系统的研究。例如前苏联在上个世纪70年代就成功进行BIOS-3的封闭物质循环系统，该系统能够做到100%的水循环和气体循环。然而这个系统仍然需要将空气催化加热到600度以上，排泄物则被烘干储存无法再循环。

   1986年，美国人Edward Bass建立了私人实验室“生物圈2号”，目的是看能否制造一个完全封闭的生命维持系统。整个系统完全隔绝了外界的空气和水，然而因为该系统没能达到基本物质的质量平衡，最终失败。

著名的“生物圈2号”，图片来自网络

日本在1998年完成了密闭生态实验系统（Closed Ecology Experiment Facilities）的建立，该系统引进了植物、动物、岩石-水圈实验装置，重要的是完全采用物理化学设备处理废物，然而由于忽略了生态系统中非常重要的一个圈层——微生物，使得该系统仅仅进行了最长两周的密闭实验。

从1989年开始，欧洲空间局ESA联合多家机构启动的微生态生命保障系统研究计划MELiSSA。MELiSSA最终的目标是包括多个舱室，实现水和气循环的完全封闭。

MELiSSA 其中有I废物降解室：主要由嗜热厌氧细菌反应器构成；II光合异养食物生产室：主要由光合异样细菌构成；III硝化室：由硝化细菌和亚硝化细菌构成 ；IV光合作用室，包含了高等植物和微藻，能够除去二氧化碳，产生生物质。Figure from ESA

中国从2004年开始提出建立自己太空生命维持系统。2013年由北航刘红教授团队带领的“月宫一号”修建完成，2014年成功进行105天的密闭实验。2016年6月17日由深圳市太空科技南方研究院组织，15家国内外机构共同参与的“绿航星际”180天封闭太空舱实验也正式开展，希望以氧气、水、食物和固体废物循环的闭合度将分别达到100%、90%、70%和60%为目标。目前项目进展过半。

   实际上闭环生态系统和工业生产类似，目的是将有原材料转化成有用的物质，如果我们要制造一个闭环系统，那么我们需要获得接近100%的回收率。那么相较于地球上生态系统的复杂程度，我们只需要改进各个生物单元的效率，提高生物单元间的耦合程度和稳定性即可。

而这，也是合成生物学超过传统的基因工程、发酵工程的地方。

那么接下来举几个例子。

传统的生活污水处理中生物处理方法大多是厌氧发酵，处理废水的微生物以聚合颗粒的形式存在，其中包含了多种菌，大都难以分离单独培养。污水处理的化学反应中包含了硫酸盐还原、产甲烷、产醋酸和脂肪酸合成等等过程，这些过程还并没有被完全了解清楚，在闭环生命维持系统中难以得到推广。因此，获得精确执行某些特定功能的微生物的开发非常重要。

多种菌形成的处理污水聚合颗粒A.细菌 B.古生菌 Figure from Vincent O’Flaherty 

  目前对污水的处理，JCVI和ARC合作生产了微生物燃料电池，通过将Shewanella oneidensis MR-1中与电流生产相关的一系列基因导入工程菌种，最终在污水处理过程中产生电流和纯净的水，这个项目还在进行中。

   类似于污水处理的微生物，动物中肠道微生物也是有非常复杂的构成，但是学界已经有人能够定向控制一些种类的肠道微生物来实现监控肠道健康和药物生产运输的功能（Mark Mimee，2015）。越来越多的合成生物学研究也预示着具有精细调控功能的生物将成为现实。

    事实上做太空合成生物学的一群人在不断开脑洞。例如Michael Flynn和John Hogan提出利用尿液中固体成分来生产各类物质：将脂肪族化合物转化成二甲胺用于清洁、将糖类转化成葡萄糖酸、半乳糖等等用于食用。如果按照每个宇航员每天59g尿液固体废物，其中有1.5%是可以回收利用产来计算，当5个宇航员执行3年的任务，将会有4.5kg有价值的的生物合成产品。

太空中的尿 Figure from Elysse Grossi-Soyster（2014）

Adam P. Arkin（2014）也通过理论计算，预期在一个火星任务周期中，将能够利用Methanobacterium thermoautotrophicum产甲烷减少56%的能耗，利用Arthrospira platensis和Arthrospira maxima两种螺旋藻提供38%的食物，以及利用改造过的工程局Synechocystis sp.PCC 6803在药物过期或者被辐射损坏时生产退烧药：对乙酰氨基酚。

   对于资源的利用，以及房屋的建造，我也想提一下和我所在实验室相关的内容。很多太空合成生物学家都看好PHA （polyhydroxyalkanoates）聚羟基脂肪酸酯这类可降解生物塑料的利用，人体产生的废物通过工程菌的转化，容易变成PHA，可用于居住地材料的打印或者零件的生产。相较于需要大规模化工过程的其他材料而言，非常有优势。然而在我看来，能做到在火星极端环境下维持材料的性质将会面临很大的挑战。

聚集在微生物体内的PHA，它好比是微生物的脂肪，用于储存能量。同时它又是高分子，有替代传统塑料的潜力。 Figure from Tsinghua Microbes Lab

绿火星：地外星球的物种生存

《绿火星》的名字，来自地球的植物开始生长使得大地呈绿色的阶段。当人类希望将各种极端的环境改造成为事宜生存的环境时，首先面临的就是严峻的极端环境。火星的大气压平均只有600Pa（地球是101KPa），大气成分为二氧化碳（~95%），氮气（~2.7%），氩气（~1.8%）和一氧化碳（~0.08%）；在缺少空气和磁场的情况下，人类和其他生物很难得到保护，因此需要遮蔽；火星温度从-140℃到20℃变化，一方面昼夜温差大，另一方面着陆点也决定了温度的变化情况；火星只有地球的3/8的重力，重力的变化不仅可能带来系统中液体、气体行为的变化，也会带来人体健康的变化。

   应对极端的环境，许多太空合成生物学家选择地球上的极端环境进行研究，包括南极洲、撒哈拉沙漠等等。各种能在极端环境下生存的嗜盐菌、嗜热菌、嗜压菌以及在极端环境下生存的古生菌、真菌等等生物都将有潜力成为底盘微生物，也有可能带来新的生物元件和新的功能。NASA有项目支持研究水熊虫Hypsibius dujardini为何能在太空极端环境中生存，这种能够在外太空存活的生物外来基因高达17.5%，也许能够为我们定向进化生物提供线索。

显微镜下的水熊虫。Figure from TC Boothby，2015

   太空合成生物学家一方面希望从极端条件下的生物中寻找灵感，另外一方面也在希望能够了解太空环境下生物的变化情况以及开发对疾病的诊断和治疗的工具。

  例如在太空中利用酿酒酵母进行DNA损伤修复的实验；进行人体骨密度、新陈代谢的相关研究等等。

BioSentinel微流控芯片，通过代谢探测染料的颜色变化，区分太空中酵母DNA损伤的程度。 Figure from NASA