基于蛋白的基因线路-Science一次两篇合成生物学重磅突破

一连两篇Science,两位合成生物学大佬，Voigt和Elowitz，同时开发新的基因线路模式，今天我们首先来学习Elowitz的工作。

合成生物学的一个重要方向是利用基因线路从而使生物计算成为可能，并进一步来控制细胞的行为。最早的基因线路是早在2000年，通过大肠杆菌中实现基因元件的互相抑制来实现，当初那篇文章的首要作者即是Elowtiz。

前期的合成生物学工作主要是基于利用转录层面的控制，蛋白蛋白之间的偶联发展相对于对于DNA元件的开发一直进展缓慢。然而蛋白质水平的电路可以使强大的新细胞行为工程成为可能。一个可组合的蛋白质-蛋白质调节系统将有助于合理的蛋白质回路设计，在该系统中，各个蛋白质组分可以相互调节，从而产生各种不同的回路结构。在这项研究中，Gao等人，展示了工程病毒蛋白酶可以作为可组合的蛋白质组分，它们可以一起在哺乳动物细胞中实现各种各样的电路级功能。在这个被称为CHOMP 的系统中，输入蛋白酶与目标蛋白酶对接并切割目标蛋白酶以抑制它们的功能。这些组件可以被连接以产生调节级联、二进制逻辑门和动态模拟信号处理功能。为了证明这个系统的实用性，他们合理地设计了一个电路，该电路响应Ras癌基因的上游激活物而诱导细胞死亡。因为CHOMP电路可以执行复杂的功能，但仍可以编码为单个转录本，无需基因组整合就可以交付，所以它们提供了一个可扩展的平台来促进生物技术应用的蛋白质电路工程。

合成生物学寻求能够合理设计赋予活细胞新功能的电路。迄今为止，大多数努力都集中在基因调控上，因为转录因子和其他核酸相互作用蛋白可以相对容易地被配置来调控彼此的表达。然而，许多自然细胞功能是通过蛋白质水平的回路来实现的，在这种回路中，蛋白质特异性地改变彼此的活性、定位或稳定性。例如，caspase介导的程序性细胞死亡是由一系列蛋白酶调节的，这些蛋白酶通过切割相互激活。合成蛋白回路可以提供优于基因调节回路的优势，包括更快的操作、与内源途径的直接耦合、单转录物递送以及无需基因组整合的功能。

关键的挑战是设计可组合的蛋白质组件，其输入和输出是相同类型的，这样它们可以形成多种蛋白质电路，就像一些电子组件可以被连接起来产生多种电子电路一样。尽管天然蛋白质结构域已经被结合来产生具有杂交功能的蛋白质，或者用于研究和生物医学应用。但是缺乏可组合性限制了我们在活细胞中设计蛋白质水平功能的能力。

病毒蛋白酶为这种系统提供了有希望的基础。它们中的许多对短同源靶位点表现出很强的特异性，这些位点可以在各种蛋白质环境中被识别和切割。天然病毒多样性提供了多种具有不同特异性的蛋白酶。病毒蛋白酶可以与强子一起使用来控制蛋白质的稳定性。他们还可以激活转录因子、合成的内含肽酶原和纯化蛋白系统中的其他蛋白酶。

科学家们首先测试了特性良好的烟草蚀刻病毒蛋白酶( TEVP ) 。为了定量TEVP活性，设计了一个报告系统，其中在桔黄色荧光蛋白和二氢叶酸还原酶( DHFR ) degron之间插入了同源切割位点( tevs )，作为阳性对照，甲氧苄啶( TMP )可以抑制该位点。我们用表达TEVP、报道者和mCherry共转染标记的不同组合的质粒转染人胚胎肾( HEK ) 293细胞，并通过流式细胞术分析细胞。

可以看到当存在TEVP时候，荧光蛋白则不会被降解。

还设计了一种互补的可抑制报道系统，其中TEVP裂解暴露了不稳定的N末端酪氨酸残基。这些设计以直接的方式推广到相关的烟草脉斑驳病毒蛋白酶( TVMVP )，并经过一些修改，推广丙型肝炎病毒蛋白酶( HCVP ) 。此外，测量每个报道者对每个蛋白酶的反应显示出有限的交叉活化。因此，三种病毒蛋白酶可用于正交。

为了能够设计复杂的电路，接下来科学家们寻求蛋白酶-蛋白酶调节。设计了一个方案来调节蛋白酶的活性。将反平行异二聚亮氨酸拉链结构域掺入拆分的TEVP 的每一半，以重建其活性。还在亮氨酸拉链和TEVP之间插入了HCVP切割位点，以允许HCVP抑制TEVP。最后，将亮氨酸拉链(与分裂TEVP上的一个拉链互补)融合到HCVP上，从而增强了它与TEVP目标对接和抑制TEVP目标的能力。这种设计成功地产生了HCVP对TEVP的抑制作用。

为了推广这种设计，进一步设计了一种类似的TEVP变体，被TVMVP抑制。基于其与TEVP的序列相似性，还设计了被HCVP或TEVP抑制的tvmv变体。

使用这个系统，他们设计了核心电路功能。从布尔逻辑开始，确定了三个设计原则，这三个原则合在一起足以实现所有八个双输入门:第一，在degron和目标蛋白质之间引入一对连续的不同切割位点可以实现OR逻辑，因为任何一个位点的切割都足以稳定蛋白质。其次，为了实现和逻辑，我们在目标蛋白的两侧

N和C末端分别侧接FKBP 和DHFR drogon，每个dragon都有不同的切割位点。在N末端，亮氨酸拉链是促进输入蛋白酶对接所必需的。在这种设计中，为了稳定蛋白质，去除两个dragon是必要的。第三，为了实现否定，我们要么使用N -末端degron策略，要么通过中间蛋白酶抑制步骤传播信号。每个基本门( OR，AND，NOR，作为否定的具体情况)与其输入的不同浓度的共传输揭示了预期的逻辑功能。此外，改变报告质粒的浓度使得能够在不中断逻辑计算的情况下调节输出水平，有助于在更复杂的电路中匹配输入和输出水平。最后，通过使用HCVP抑制剂亚松森普雷维和雷帕霉素诱导的TEVP，我们发现这些门也可以由小分子输入控制。因此，这些结果表明，三个核心门在多种输入方法中表现出稳健和可调的操作。

除了布尔逻辑之外，模拟信号滤波还可以实现许多细胞功能，例如选择性响应特定输入浓度范围的能力。非相干前馈回路( IFFL )为该功能提供了一个简单的实现方式，在该线路中，输入既激活又抑制同一目标。在IFFL的启发下，他们将激活臂和抑制臂结合起来，在激活臂中，TEVP去除了C末端的degron，在抑制臂中，tvmv展示了不稳定的N末端酪氨酸。为了调整带通的位置和锐度，我们还引入了基于抑制臂上HCVP和tvmv之间的相互抑制的正反馈回路，使得HCVP表达量为tvmv活动设定了阈值。

为了能够在Ras激活发生的质膜上高效地依赖蛋白酶诱导细胞死亡，通过从人类H - Ras 的C末端掺入20个氨基酸的膜靶向序列( MTS )，对TEVP激活的casp 3变体进行了定位。

接下来，为了将Ras激活输入耦合到TEVP，将TEVP的N端半部分融合到Ras，其C端半部分融合到Raf的Ras结合结构域( RBD )，后者结合到活性形式的Ras (。在这个设计中，Ras的上游激活器应该重建RasTEVP ，从而激活casp 3。

与转录系统相比，CHOMP电路可以提供不同的功能。就速度而言，蛋白酶可以快速响应输入蛋白酶活性的增加。CHOMP电路也可以在细胞内的特定亚细胞位置并行工作。因为CHOMP电路具有相对紧凑的基因设计，并且不需要与DNA的调节性相互作用，所以它们可以通过基因治疗载体或其他病毒被引入分化的甚至死后的细胞中，并且可以提高溶瘤病毒治疗的特异性。综合来看，将转录或翻译调节与工程蛋白酶结合起来的混合电路可以提供碱基配对相互作用的可编程性以及蛋白质水平的操作。例如，现有的癌症检测电路可以有条件地表达CHOMP成分，以增加特异性，并耦合到蛋白质介导的输入和输出。综合这些能力，人们可以想象基于CHOMP电路的智能疗法。