【推荐阅读】CAR-T的现状和未来（完整版）

感谢五加和研究所基因治疗公众号，本文终于连载完了。

CAR-T带来的新曙光

■自古以来，人们不断地与癌症进行斗争。科学家们考古发现的木乃伊是死于癌症，敬爱的周总理死于癌症，报纸杂志中风光无限的水果总裁死于癌症，电视剧中美丽的女主角患上了癌症，或许你也听闻某位长辈过世的原因是罹患了癌症，甚至被告知前几天春晚上那个活泼可爱的小男孩还那么小竟然也患有癌症。于是惊讶和慌乱一起袭来，我们拼劲全力想要进行反击，一轮轮的手术、放疗、化疗却仍然抵挡不住它一波又一波的猛烈攻势，无奈的发现终究道高一尺魔高一丈~

■当艾米丽•怀特黑德（Emily Whitehead）还活着的消息传来，人们看到了这场战争的曙光。这个小姑娘5岁就被诊断出癌症，6岁接受了免疫治疗，自7岁生日当天醒来。之后的两年仍然身体健康，可以跟家里的小狗滚作一团，可以上学，可以学钢琴，可以像其他孩子一样体验生命的美好。小艾米丽接受的是一种疯狂的、之前从未用于儿童身上的试验性疗法：抽取6岁的小艾米丽的血液，在其中提取她的白细胞，利用改良的艾滋病毒对这些白细胞进行改造，教会它们识别肿瘤细胞并进行杀伤。改造后的白细胞又重新输回小姑娘的体内。经历了噩梦般的连续高烧后，小艾米丽挣脱了死神的束缚重新醒了过来，医生和科学家们的疯狂试验成功了。CAR的出现使人们在对抗癌症这一隐性又无处不在的恶魔的战争中，找到了扭转战局的契机。

■将嵌合抗原受体（CAR）导入T细胞中从而产生肿瘤特异的T细胞。一旦T细胞表达这种受体，便可用单个融合分子与抗原进行特异性结合并激活T细胞。大多CAR由一个抗原结合区/胞外区/跨膜区以及一个在结合抗原后能够活化T细胞的胞内信号区组成。Gross与其同事的早前研究表明，T细胞表达的抗体单链的的可变区(scFv)联合T细胞信号区能够调控T细胞的功能和特异性。肿瘤特异性人T细胞改造和扩增技术的进步使得这一技术成为可能的治疗策略。

CAR改造T细胞的优势和信号

CAR改造T细胞:优势

■CAR识别肿瘤抗原是以HLA非依赖的方式，这就使得经过CAR改造后的T细胞能够跨越HLA表达下调这一肿瘤细胞免疫逃逸机制。并且由于其肿瘤识别是非HLA依赖性的，CAR的应用能够突破病人HLA分型的限制。CAR改造的T细胞可针对任何细胞表面抗原，包括蛋白/糖和糖脂激起的多克隆抗体，这使得CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标。CAR改造能够调节大多数T细胞亚群，包括CD4，CD8，naïve，记忆或效应T细胞。改造CAR能够搭载一个或多个T细胞激活信号，这或许能提高T细胞的增殖/生存和裂解靶细胞的能力。不仅如此，T细胞基因改造不单局限于激活信号，还能够设计T细胞搭载潜在的抗癌免疫调节因子（如细胞因子）以在肿瘤微环境中增强抗肿瘤效果。最后也是最重要的一点是，这一技术能够在相对较短的时间内产生大量有肿瘤杀伤效力的T细胞，从而使得这一技术走向临床成为可能。

CAR改造T细胞:瞄定

■CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原（tumor-associated antigen, TAA）结合区（通常来源于多克隆抗体抗原结合区域的scFV段），一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区。目标抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性来讲都是关键的决定因素。理想的目标抗原只在肿瘤细胞表达并且对肿瘤细胞的存活有重要意义。不幸的是表达的大多数TAA不具备肿瘤细胞限制性，从而导致“是靶向/非肿瘤”毒性的产生。历史看来，CAR改造的T细胞只能瞄定目标细胞表面抗原。然而，瞄定细胞内抗原(通过HLA递呈)的CAR也已经被设计出来了。

■目前应用广泛T细胞表达的是CD19抗体，这种抗原不但表达于所有正常的B细胞表面也表达于多数恶性增殖的B细胞表面。由于CD19在造血干细胞中不表达，使用抗CD19的CAR-T细胞进行治疗，其毒性也被限制于B细胞再生障碍性贫血。 这种“是靶向/非肿瘤”毒性在治疗B细胞再生障碍性贫血中是可以忍受的。还有另外一些CAR-T的靶向分子，包括瞄定ERRB2（HER-2/neu）治疗肺部和前列腺癌，瞄定前列腺特异性抗原治疗前列腺癌，瞄定CAIX治疗肾细胞癌，瞄定Lewis Y以治疗肺癌和卵巢癌等等。尽管这一列表尚不详尽，但它清晰的表明CAR-T细胞在抗肿瘤方面的广泛应用。

■尽管大多CAR利用scFV瞄定肿瘤，也有一些利用融合了跨膜信号区的受体配体使CAR的研究更加深入的报道，其中包括anti-VEGFR2，anti-avb6，anti-Her3/4 receptor等。也有一些报道了加载NKG2D受体并CD3z链以增强CAR抗肿瘤效力方案的研究。其中，T细胞瞄定的是广泛表达于多种肿瘤细胞表面的NKG2D配体。为了研究出一种“通用”的CAR，Ang和同事们开发出一种抗FITC的CAR。将FITC连接到治疗性的分子上，如多克隆抗体，配体或核酸适体，能够特异性找到一种或多种肿瘤相关抗原（TAA）以瞄定感兴趣的肿瘤细胞。基因改造的T细胞能够表达抗FITC的CAR来瞄定FITC标记的肿瘤。这种方法能够瞄定多种TAA以限制肿瘤细胞通过下调单个靶分子进行逃逸。更有甚者，这种策略使得一种CAR治疗多种肿瘤成为可能。

■CAR设计的改进和T细胞的激活无不涉及抗体识别区域亲和力的增强。增强CAR抗原亲和力会提高肿瘤靶向性并伴随抗原表达的下调和T细胞激活的增加。然而Chmielewski说明，通过CAR结合抗原方式进行T细胞的最大量激活并不依赖于抗原结合的亲和力。同样值得注意的是，低亲和的受体可以利用目标抗原的高低表达的差异区分不同肿瘤，能够利用这种特性降低“是靶向/非肿瘤”毒性，从而使得CAR-T细胞的毒性限制于过表达目标抗原的细胞上。另外，在选择高亲和力的CAR抗原方面需要特别小心，一旦与抗原的结合过度紧密，效应T细胞很可能不能结合多种目标分子而限制了其杀伤效力。

■由于目前的CAR大多基于鼠源抗体的scFV进行设计，这种异源模型可能会引起不希望出现的宿主抗CAR反应。这种针对CAR的反应已有报道。其中一个阻止这种反应的策略是将scFV片段人源化或利用人源抗体设计CAR。这种CAR设计的人源化备选方案目前尚待建立，并为今后临床前和临床研究提供保证。

CAR改造的T细胞：信号、迁移和存续

信号

■优化CAR设计中T细胞活化信号区仍然是争论的焦点。第一代CAR介导的T细胞激活是通过CD3z链或FceRIg上的酪氨酸激活基序完成的。CD3z链能够提供T细胞激活、裂解靶细胞、调节IL-2分泌以及体内发挥抗肿瘤活性所需的信号1。根据文献报道，第一代CAR改造T细胞的抗肿瘤活性在体内受到了限制，氮气抗肿瘤潜力已被临床前实验证实。只有“信号1”的T细胞反应无能，细胞因子分泌减少，增殖减少最终导致改造T细胞的凋亡。肿瘤细胞的清除还需要肿瘤细胞表面表达的共刺激信号。

■为了加强CAR激活信号并突破第一代CAR的限制，结合了共刺激结构的第二代CAR发展起来了。第一个被详细研究的T细胞共刺激信号受体是CD28，它能够与靶细胞表面的B7家族成员结合。基于目前的T细胞激活模型，CD28提供了T细胞激活的第二刺激信号（信号2），使源自TCR/CD3复合体的“信号1”扩大。CD28的共刺激能够促进T细胞的增殖，IL-2的合成和表达以及抗凋亡蛋白Bcl-xL的分泌。为模拟这种T细胞的激活过程，第二代的CAR设计中同时包括了CD3z链的“信号1”和CD28的“信号2”。许多研究都表明，搭载了“信号2”的第二代CAR与第一代CAR相比，抗原特异性不变，T细胞增殖、细胞因子分泌增加，抗细胞凋亡蛋白分泌增加，细胞死亡延迟。不仅如此，CAR中的CD28还能够使改造后的T细胞抵消肿瘤细胞微环境带来的不利影响。

■使用不同的共刺激分子使得第二代CAR得到不断发展。将CD3z信号与其他B7家族成员或肿瘤坏死因子受体家族成员成员结合设计CAR的研究已有报道。之后有研究将CD28用CD137（4-1BB）进行替换。使用CD28还是4-1BB，不同的第二代CAR究竟孰优孰劣，不同的研究者用不同的肿瘤在体内和体外的研究中得到的结果不尽相同。

■除了CD28和4-1BB之外，使用一种NK细胞受体CD244的思路也被提出来。与第一代CAR相比，这种设计能够增加对肿瘤细胞裂解的记忆效应以及CAR介导的杀伤效应。第二代CAR的三种不同设计之间的比较尚未实施。

■为了进一步改良CAR的设计，许多研究组开始着眼于发展第三代CAR，不仅包括“信号1”、“信号2”，还包括了额外的共刺激信号。不同研究者们用不同材料开展的研究所得到的第二代CAR和第三代CAR的比较结果是矛盾的。第二代和第三代CAR之间的直接比较尚未开展，故二者之间哪种设计更胜一筹尚无定论。然而目前第二代和第三代的设计都各自已有临床试验的应用，后续如何仍需持续关注。

迁移

■基因改造的肿瘤细胞靶向T细胞必须迁移至相应位点以根除疾病。CAR-T细胞能够迁移到肿瘤周围这一点已经被实验多次证实，新近的临床试验为这一点提供了更有力的证据：基因改造后的T细胞能够表达次生CAR，从而定位于发病部位。来自不同研究者的结果都表明，将CAR改造的T细胞注入病人体内，CAR能够迁移到不同的组织发挥作用。虽然CAR-T的迁移能力已经得到了实验验证，然而我们仍然不清楚T细胞的基因改造和体外扩增是否会对其迁移所必须的趋化因子或细胞因子造成影响。其中一个促进T细胞迁移的策略，是从改造基因以表达细胞因子受体入手。许多研究已经通过在CAR-T细胞中表达CXCR2（CXCL1受体）和CCR4（CCL17受体）来实行这一原则。除却这一策略，找到是T细胞迁移到肿瘤位点的其他方法对于成功消除肿瘤来讲至关重要。

存续

■为了成功消除肿瘤，靶向性的T细胞必须能够在体内存在足够长的时间。利用肿瘤淋巴细胞进行的细胞免疫研究发现，过继的T细胞的持续存在时间与临床疗效之间正相关。调节化疗可以通过多种途径延长过继T细胞的存在时间。最初接受CD19靶向性T细胞治疗的病人没有联合调节性化疗，这使得后续T细胞在体内的存在变得几乎无法检测。而之后的病人接受了联合调解性化疗的治疗，过继免疫6周后仍然能在病人的骨髓中找到基因改造的T细胞。

CAR改造的T细胞：功能和毒性

功能

■癌症的根除需要CAR改造T细胞在过继后能够持续保持细胞毒性。患者体内肿瘤微环境中的Treg细胞、髓源抑制性细胞和免疫抑制分子/细胞因子会抑制外来和内源T细胞的抗肿瘤活性。早期CAR-T细胞临床效果令人失望的原因就在于患者肿瘤微环境的抑制。有证据表明携带CD28的CAR-T细胞在体内能够抵抗Treg细胞的抑制作用。然而实验中用到的Treg（iTreg，诱导型Treg）细胞Foxp3的表达并不稳定。天然存在的Treg无论在体内还是体外都能够抑制改造后的T细胞表达第二代CAR。辐射和化学药物下调Treg细胞的数目从而能够使的基因改造的T细胞清除肿瘤细胞。

■根据下述临床实验的报告，利用CAR改造T细胞消除肿瘤仍然是目前最有效的抗肿瘤手段。CAR-T细胞过继后续反应的一个间接证据是“是靶向/非肿瘤”毒性的存在（如B细胞再生性贫血障碍或瞄定CD19分子而引起的低丙种球蛋白血症）。近期利用抗CD19的CAR进行的实验证明其过继后能引起B细胞再生性贫血障碍。促炎症细胞因子的增多是另外一个过继后T细胞功能的标志。CLL（慢性淋巴细胞性白血病）病人外周血和骨髓中的促炎症细胞因子的增多与CAR改造T细胞的扩增协同出现。

■通过对CD107a的测定发现过继转移的T细胞能够在体内保持其下调目的基因的靶向性。

毒性

■“是靶向/非肿瘤”毒性远非B细胞再生性贫血障碍那么简单。一个结肠性转移的患者在接受消耗性化疗接连ERBB2靶向的T细胞过继5天后死亡。推测是由于肺部聚积了大量的改造的T细胞，它们识别肺上皮少量表达的ERBB2后引起了促炎症细胞因子的大量释放。促炎症细胞因子的释放引起了肺部毒性、多器官衰竭，进而导致病人的死亡。用表达CAIX的第一代CAR治疗肾细胞癌时，11例病人中有5例被报道发现了肝脏毒性。总结病因是改造后的靶向型T细胞可以识别胆管上皮低水平表达的CAIX。上述研究凸显了在相同时期与正常组织相区别的特异性靶向抗原的重要性。

■来自凯特琳癌症研究中心的数据显示有一位病人接受T细胞过继两天后死亡，在综合考虑了所有临床数据包括尸检结果后发现引起病人死亡的原因在于感染而非过继的T细胞。尽管如此，基于安全性的，该中心将T细胞过继调整为化疗后两天。用调整后的方案为5位病人进行了CAR-T细胞治疗没有再出现不良事件。

CAR-T细胞试验与未来挑战

第一代CAR-T细胞试验

■第一代CAR改造的T细胞的有效性已经有多家单位开展临床实验进行检验。总体说来，早期利用第一代CAR-T开展的临床试验没有表现出显著的有效性。不仅如此，这些实验间在许多方面都有明显差别，包括目标基因选择，基因转导方式，体外扩增方式，细胞数量，IL-2的用量以及调理治疗选择。

■尽管如此，在促成有效的CAR-T细胞治疗方面，这些实验为我们积累了宝贵的经验。Lamers报道了他们用抗AIX的CAR-T联合或不联合IL-2注射的方案治疗转移性肾透明细胞癌的经验。输入CAR改造的T细胞导致了8个病人中的5位出现肝脏毒性。总结原因，很可能是CAR-T对胆管上皮CAIX的靶向造成的。另外三位病人在接受T细胞输入前预先进行了抗CAIX单克隆抗体的注射（以封阻正常肝组织中CAIX的表达），接受这种修改方案治疗的病人并没有表现出肝脏毒性。参与该实验的病人体内CAR改造T细胞的持续时间受限，也没有出现可见的临床反应。重要的是，这一治疗能激起病人体液和细胞抗CAR的反应，这或许能够解释改造T细胞不能持续存在的原因。

■Kershaw描述了用抗叶酸a受体的CAR改造T细胞治疗卵巢癌的14位病人的情况。大多数病人接受了IL-2皮下注射（n=8）并表现出IL-2的毒理反应。与Lamers的实验相同，用放射性铟标记T细胞发现，改造后的体细胞存续时间有限并且肿瘤定位受限。有三位病人（除去检测的六位病人）没有观察到治疗反应和抑制因子的出现，改造T细胞体外针对叶酸受体的抗肿瘤反应下降。

■Park报道了用CAR改造的L1-CAM（L1细胞粘附分子，CD171）CD8+细胞过继治疗神经母细胞瘤的六位病人的情况。与大肿瘤负荷的病人相比，肿瘤负荷较轻的病人没有观察到明显的临床反应，但外周血中的T细胞存续时间增加（通过Q-PCR检测）。

■Till与其同事报道了用CD20靶向的CAR-T细胞过继治疗难治或复发性惰性NHL的七个病例。第一批试验中，没有观察到临床反应且T细胞存续时间有限。第二批试验中，接受了IL-2皮下注射的患者体内改造T细胞的存续时间延长。通过正电子发射断层扫描（pet），第二批试验中有一位患者部分缓解还有一位患者肿瘤代谢活性下降。

■Louis和Pule分别用病毒和非病毒特异的两群GD2靶向的CAR-T细胞治疗19位神经母细胞瘤患者。3例患有活动性疾病（骨或骨髓疾病）的患者在接受过继后达到完全缓解，其中两位在接受T细胞注射1年和4年检测时仍然保持完全缓解。改造T细胞的存续时长视注射物中辅助细胞（CD4+）和中心记忆（(CD45RO+CD62L+）细胞比率多少而定。而病毒的特异性对基因改造T细胞的存续没有影响。不仅如此，改造T细胞的存续时长与卓越的临床效果相关。

■Jsen等人用CAR改造的T细胞治疗4位反复发作NHL（非霍奇金淋巴肿瘤）患者。两名弥漫性大B细胞淋巴瘤的患者在接受了自体造血干细胞移植后又接受了CD20特异性CAR的 CD8+细胞毒T细胞的治疗。两名滤泡性淋巴瘤患者接受了CD19特应性CAR的多克隆T细胞和低剂量IL-2皮下注射治疗。改造T细胞的体内存续时间仍然有限，两名病人体内抗转基因的细胞免疫反应明显，没有发现可见的临床反应。

第二代CAR-T细胞试验

■临床数据数据预示了这一领域的广阔前景，许多研究中心利用第二代CAR改造的T细胞开始了临床研究。Kochenderfer对利用针对CD19加载了CD28的第二代CAR治疗NHL病人进行了报道。这位患者在接受了改造T细胞并IL-2治疗后又接受了包括环磷腺苷和氟它拉宾的调理治疗，这种治疗使得患者得到了淋巴细胞瘤部分缓解（直至32周），继发B细胞再生障碍性贫血至39周，血液中CAR-T细胞持续存在至27周。

■Savoldo用CAR-T细胞治疗复发或难治的NHL患者，共六例。非预处理的患者同时接受同样针对CD19的两种T细胞，第一代CAR和加载CD28的第二代CAR。试验结果显示出加载了CD28的第二代CAR改造的T细胞出色的存续、扩增和病灶靶向迁移的能力。遗憾的是，这一实验中并没有显示出肿瘤的持续消退。

■又有用针对CD19加载CD28的第二代CAR治疗9例患者（8位CLL，1位ALL）的试验。除了1位病人在接受T细胞过继两天后死亡之外，其他患者均对过继的T细胞能够很好地耐受。其中六位患者在T细胞过继之前接受了环磷酰胺治疗。化疗能够增加改造T细胞的存续时间但外周血中的肿瘤负荷却与之成反比。四名霍奇金氏淋巴瘤患者中有三位在T细胞过继后接受了化疗，其中一个名患者治疗后通过临床和影像学分析肿瘤明显减少。一名急性淋巴白血病（ALL）患者在接受异体造血干细胞移植钱出现了B细胞再生障碍性贫血。改造T细胞具备向病灶迁移的能力（骨髓、淋巴结、肝脏）并能在体内保持细胞毒性。

■Kalos和Porter，June与其同事描述了用靶向CD19加载4-1BB的二代CAR治疗三名CLL病人的情况。在这一研究中，在T细胞输入前病人接受了化疗。令人惊异的是，过继后经改造的T细胞能够扩增至1000倍，并迁移到发病部位（骨髓），过继后6个月仍然能在体内检测到高表达（用流式细胞术和Q-PCR检测外周血和骨髓）。三位患者都对治疗响应，两名完全缓解，一名部分缓解。肿瘤裂解效应与外周血中CAR-T细胞的数量和促炎症细胞因子的水平直接相关。另外，B细胞再生障碍性贫血、浆细胞数量下降和低丙种球蛋白血症在这些病人中都非常显著。

第三代CAR-T细胞实验

■有一位患有结肠癌的病人接受了ERBB2靶向的第三代CAR（CD28/4-1BBCD3z）的治疗。病人在接受改造T细胞输入后连接化疗（环磷酰胺、氟达拉滨）后第五天死亡。改造T细胞的“是靶向/非肿瘤”靶向致使促炎症性细胞因子大量释放，引起肺部毒性，多器官衰竭最终导致病人死亡。

未来的挑战

■肿瘤免疫治疗的终极目的是治愈肿瘤的同时又没有传统治疗的毒性。CAR改造T细胞的临床前和早期临床研究使得这一目标变得不再遥不可及。用CAR-T细胞治疗癌症有多重优势：靶抗原的非HLA依赖，对多数病人具有广泛适应性，能够规避肿瘤逃逸并能短时间内扩增肿瘤特异的T细胞群。这一技术的成功应用需要分离特异性表达于肿瘤细胞的靶抗原从而降低技术本身的毒性引发的风险。另外，根据新近的临床报告，这一治疗成功的先决条件是过继转移后的CAR-T细胞能够在体内持续存在。已经利用小鼠模型证明，多次注射改造后的T细胞能够人为延长T细胞生存时间并增强抗肿瘤效力。然而这一技术应允许一次T细胞输入即可终生保持其增殖、存续和严格的靶向细胞毒性。并且这一技术根本而言效率不高且价格昂贵。对肿瘤靶向T细胞存续相关因子的研究仍需继续深入，信号、肿瘤负荷、调节性化疗、T细胞表型以及补充性细胞因子的研究都牵涉其中。不仅如此，据现有观点看来，许多早期实验已经证明免疫系统会对过继的细胞发生反应。这种现象的存在会限制过继细胞的存续时间和效力也就不足为奇了。更进一步来说，这一疗法的成功应用也使针对弱免疫原性、免疫耐受和/或免疫抑制诱因的研究变得不可或缺。

■近期报道了这一技术在治疗血液系统恶性肿瘤中的成功应用，如何将该技术用于实体瘤的治疗尚待进一步研究。早期的研究着眼于稳定产生肿瘤靶向的T细胞，而肿瘤周围抑制性的微环境却可能使CAR-T细胞变得毫无效用。因此，未来这一疗法的研究方向在于产生能够抵抗肿瘤微环境中免疫效应分子对CAR-T细胞的抑制和对其凋亡的诱导。不仅如此，除了要抵抗宿主的肿瘤微环境，这一疗法还应该能够调动内在抗肿瘤反应的功能。对肿瘤细胞单个抗原的瞄定可能不是肿瘤负荷降低的初始原因，其对缺乏这一靶抗原的肿瘤细胞扩增的筛选才是。因此，尽管对T细胞的基因改造允许我们特异性靶向肿瘤细胞并且可能克服宿主肿瘤微环境的抑制，同时又不牵涉免疫系统内源因子的招募和激活，但仍然很可能不足以治愈大多数病人。未来我们需要CAR-T细胞激活内源抗肿瘤反应（如TILs，NK细胞，先天免疫系统）。如果这一策略有效，内源性抗肿瘤反应的激活会引起表位扩展这一观点才有说服力，肿瘤才能得到根除。

■尽管困难重重，这一领域在相对短的时间内有了长足发展，所有肿瘤疗法的是否成功的唯一在于它们在临床患者身上的疗效。为了全面判断这一疗法的有效性，有必要实施多中心联合临床试验，而需要大量人力和资金支持。

■这里，我们用一张图简要列出成功运用CAR-T细胞免疫疗法治疗癌症的重点要素。目标基因，信号区，迁移能力，持续性，功能限制，病人的病情甚至调节机制，每一项都至关重要。这一疗法未来的重点人在于改进CAR-T的设计以克服肿瘤微环境的限制并激发抗肿瘤的内在力量。

■当然，资金的限制也曾为领域内的研究者们造成一定困扰。然而这一疗法在2013年的美国血液年会上一夕爆红，如今早已成为投资界顶级主题。动辄上亿美元的海量资金注入早已将这一障碍消除殆尽。目前需要担心的恐怕不是资金的短缺，而是估值过高所带来的风险。无论如何，CAR-T免疫疗法潜力巨大，未来的路将走向何方，我们拭目以待。

刘海燕博士 编译

（全文完）

参考文章：

Curran, Kevin J., Hollie J. Pegram, and Renier J. Brentjens. "Chimeric antigen receptors for T cell immunotherapy: current understanding and future directions." The journal of gene medicine 14.6 (2012): 405-415.