孕期补充菊粉能减轻丙母体和胎儿的脑损伤

母体大脑区域蛋白质羰基的提升水平与菊粉的补充是完全标准化。更重要的是，菊粉补充显著增强ACR大鼠盲肠双歧杆菌的数量，其与神经复原的效果有很好的相关性。这一点在ACR暴露期间母体皮质修复多巴胺水平和胎儿脑乙酰胆碱酯酶活性中得到证实。此外，菊粉补充具有显著保护ACR引起的线粒体功能障碍。尽管怀孕期间补充菊粉减弱ACR诱导的神经毒性的影响的确切的机理需进一步调查，但是我们假设它可通过增强肠道菌群和废止氧化应激。此外，我们的研究提供了一种实验方法探索在怀孕期间降低发育神经毒物的不利影响这方面益生元低聚糖的神经保护作用。

最近证据表明，肠道菌群具备影响大脑发育和行为的倾向(Cryan and Dinan, 2012)。流行病学和动物研究表明细菌菌株的扩散对大脑化学物质有有利影响（Messaoudietal，2011; CollinsandBercik，2013）。啮齿动物活细菌补充剂（益生菌）给药时显示出改变营养细胞因子（脑源性神经营养因子，BDNF）的基因表达（O'Sullivan等，2011）。有趣的是，益生菌混合物能缓解大鼠焦虑和人类与血清皮质醇水平相关的心理困扰（Messaoudi等，2011）。虽然这些确切的机制仍不清楚，但是有可能与参与抑制氧化自由基和促炎细胞因子水平有关(Cryan and O'Mahony, 2011)。因此，使用益生元来刺激有益肠道菌群的生长的饮食干预正被探索作为一种工具来实现各种有益大脑的作用（Marques等人，2014年）。

果聚糖如菊粉，是植物衍生的不易消化的碳水化合物（NDO）主要通过盲肠菌群消化，(Yasudaet al., 2007)，增加固有细菌群落(Kelly,2008; van Vlies et al., 2012)。此前，已经报道在怀孕期间补充非消化性寡糖可改善各种代谢紊乱(Qiu et al., 2008)。此外，研究已经表明大鼠接受菊粉预防性治疗显著缩减致癌性生物标志物的水平。最近一项研究报告菊粉具有减轻人结肠上皮细胞株LPS诱导的氧化应激的潜力。

丙烯酰胺（ACR）是一种乙烯基、水溶性烯，在生产的胶和塑料中食用，在各种商业上应用（LoPachin，2004; ErkekogluandBaydar，2014）。 ACR被证明对人类是具有神经毒性，影响中枢和外周神经系统。因其在普遍食用的食物如炸土豆，饼干和咖啡等的油炸/烘烤的过程中形成，这个毒素已经获得巨大的关注(JECFA, 2011)。对啮齿动物的研究已证明ACR通过胎盘(Annola etal., 2008; von Stedingk et al., 2011)并导致生殖/发育毒性、胎儿的不良影响如低出生体重，骨骼异常(Manson et al., 2005; El-Sayyad et al., 2011)和神经发育毒性(Takahashi et al., 2009;Ferguson et al., 2010; Garey and Paule, 2010; El-Sayyad et al., 2011)。氧化应激的参与和ACR诱导的神经毒性的激怒应答已被广泛接受(Lopachin andGavin, 2008; Prasad and Muralidhara, 2012, 2013)。

此外，ACR能够形成偶合物，降低谷胱甘肽（GSH），由此产生的复合物通过细胞色素P450（亚型CYP2E1）代谢以形成环氧丙。最近的证据表明丙烯酰胺会在突触前蛋白中形成化合物，进而导致神经传输异变或者与神经元能量生产相关的酶的失活。

令人信服的证据表明，化学药剂在环境中广泛传播是神经系统异常的重要诱因(Grandjean and Landrigan, 2006, 2014)。脑发育是特别令人感兴趣的：因为在脆弱性的关键窗口，它极易受到神经毒素损伤(RiceandBarone,2000)。考虑到广泛的工业应用和人体长期接触ACR导致的慢性毒害神经的影响（这种影响在子宫内开始），制定具体的治疗策略废除ACR诱导胎儿毒害神经的影响是相关的。因此，本研究中我们的主要目的是了解大鼠模型中，给怀孕期间母鼠补充菊粉（一种广泛应用的NDO）是否具有衰减ACR诱导的氧化应激和神经毒性的潜力。作为前奏，我们研究了不同剂量ACR对妊娠期间大鼠的某些生化干扰（氧化损伤和神经毒性）特性。随后，我们研究了菊粉补充对ACR中毒母鼠以及胎儿大脑的改善作用。

3.结论

3.1妊娠期大鼠接触ACR

3.1.1ACR对妊娠参数的影响

大鼠每日食物和水（水中含ACR）的摄入量（低剂量 - 50ppm的;中剂量 - 100ppm的;和高剂量-200 ppm的）对照组高度吻合（数据未显示）。另外，任何剂量饮用水中消耗的ACR，对大鼠母体的体重没有显著效果（表1）。 ACR接触并没有植入物的数量的显著变化，而显著减少的胎盘重量（高剂量 - 20％）和胎儿体重（中剂量19％和高剂量36％）。累积ACR摄入通过大鼠第1个7天（GD6-12）和第2个7天（GD13-19）的平均摄入水的量计算的得到。三组之间的ACR平均摄入量：50，100和200ppm剂量的分别为-1.91，3.71和6.94毫克/大鼠/日。

3.1.2.ACR在母鼠大脑和胎脑诱导的氧化应激

由于ACR的低剂量时，没有任何生化参数显著改变，该剂量数据尚未表示。而中等剂量只有边际效应是明显的， ACR高剂量有效诱导母亲和胎儿环境的氧化应激。以MB区域（皮层：21％;小脑：27％）和FB（60％）的活性氧水平显著升高（图1A）。而MB区域（皮层：21％和小脑：26％）和FEB（37％）MDA水平（脂质过氧化作用的指标）显着升高（图1B），HP的基础水平仅在MB的小脑（25％）和FB（24％）显著增强（图1C）。

3.1.3 ACR接触对抗氧化和二阶段解毒酶活性的影响

高剂量ACR导致 MB小脑（20％）和FB（18％）的CAT的活性水平显著减少（表2）。此外，ACR仅降低了MB小脑（20％）SOD活性。同样，MB小脑（19％）和FB（24％）的GPx活性显著降低。然而，ACR中、高剂量时显著增强的GST的活性水平（中剂量：MB皮质 - 27％，FB - 18％;高剂量：MB皮质 - 29％和小脑 - 27％，FB：23％）。

3.1.4 对胆碱功能的影响

高剂量ACR导致MB区域（皮质：34％;小脑：44％）和FB（37％）乙酰胆碱酯酶活性的增强（图2A）。同样地，MB的区域（皮层：48％;小脑：55％）的非特异性胆碱酯酶胆碱酯酶（BuChE）的活性也显着增强，但FB少量（图2B）。

3.2 口服菊粉补充剂对ACR诱导的神经毒性的保护作用

3.2.1开放场地实验 - 菊粉对母鼠探索行为的调节作用

ACR曝光显著影响大鼠之间的探索活动：通过大鼠在中央区域中的条目数的减少反（52％）应（CTR与ACR，5.2±0.5对2.5±0.3）。然而，补充菊粉的ACR大鼠相对于空白对照的ACR显示更多在中心地带的探索（图3A）。此外，ACR暴露的大鼠花费在中心开放场地探索的持续时间相对较小（CTR与ACR，8.3±0.5与6.1±0.3秒），但是，如图所描绘，补充菊粉对ACR大鼠花费的时间没有显著影响。

3.2.2菊粉对胎盘和胎儿体重的影响

如归纳于表3中， ACR大鼠和那些补充菊粉的ACR大鼠植入物并没有显著变化。有趣的是，补充菊粉的ACR大鼠相比于ACR大鼠表现出显著的恢复胎盘重量的能力（ACR：INU+ ACR=0.40±0.06：0.48±0.03）。然而，菊粉补充不影响ACR诱导降低的胎儿体重。

3.2.3菊粉补充废止母鼠和胎儿的大脑区域ACR诱导的氧化应激

菊粉补充剂显著衰减母体和胎儿的大脑由ACR诱导的生物化学的变化（氧化应激标记物，GSH和蛋白质羰基水平）（表4）。ACR接触增强MB皮质和小脑的ROS水平，而菊粉补充表现出显著抑制皮层氧化应激标志物的水平升高。同样地，FB的ROS水平升高，补充菊粉的ACR大鼠相比于ACR大鼠ROS水平显著减少。此外，ACR诱导的大鼠皮质和小脑MDA水平的上升完全被菊粉的补充抵消。虽然MB和FB区域的GSH水平轻微下降，但是菊糖补充剂并没有显着影响GSH水平。菊粉补充使大鼠母体大脑区域MB和FB的ACR诱导增强的PC水平正常化。

3.2.4菊粉对抗氧化酶和还原型谷胱甘肽转移酶的调节作用

菊粉补充仅恢复大鼠MB小脑由ACR接触诱导减少的SOD活性（图4A）。有趣的是，补充菊粉的ACR大鼠的FB表现出显着增强的SOD活性。同样地，ACR显著降低FB的CAT活性，菊粉补充防止此ACR诱导作用（图4B）。此外，通过补充菊粉能够显著减弱MB皮层（43％）和小脑（25％）TrxR活性水平的减少（图4C）。然而，ACR增强MB和FB的GST活性水平，补充菊粉后显著升高（图4D）。

3.2.5菊粉对AChE（乙酰胆碱酯酶）活性和多巴胺（DA）的水平的影响

ACR诱导显著升高MB区域乙酰胆碱酯酶的活性水平，菊粉补充恢复了小脑中部分的活性水平（图5A）。同样，IN + ACR 处理的大鼠的FB表现出较小的酶活性的恢复。 ACR接触显著降低了MB的皮层（19％）的DA水平，而FB上没有影响。然而，随着菊粉的补充皮质的多巴胺水平得到恢复（图5B）。

3.2.6菊粉缓解由ACR诱导的线粒体功能障碍

ACR处理仅导致MB复合物I-II的活性的显著降低（皮质29％和小脑22％），菊粉补充使这种降低得到衰减（图6A）。此外，菊粉补充使ACR大鼠MB的小脑减少的MTT水平恢复到正常状态（图6B）。

3.2.7菊粉补充改变大鼠盲肠特性

空白对照组和处理组的盲肠湿重、双歧杆菌和乳酸菌的数据示于表5. 总湿重在各组间没有显著变化。然而，ACR处理显著降低盲肠双歧杆菌（15％）的数量，补充菊粉的ACR的双歧杆菌的数量显著增加（ACR： IN + ACR,8.23×10 8±0.04：9.16×108±0.06，P<0.05）。

3.3盲肠双歧杆菌和DA水平的相关性

皮尔森相关分析显示， ACR和ACR+IN处理组的盲肠双歧杆菌数量和母鼠皮层DA水平具有显著的相关性（皮尔逊的R =0.59，P <0.05）；然而，盲肠细菌数和胎儿大脑多巴胺的水平无这样的相关性。

4.讨论

最近的证据表明共生菌群对神经精神和行为病理学的积极效果(Desbonnetet al., 2008; Messaoudi et al., 2011; Bravo et al., 2011)。另外，在增殖菌群的生长方面益生元的功效是公认的，并有可能对大脑提供益处。但是，益生元可能调节发育中大脑的神经毒性反应（由于母体接触神经毒物)的潜能鲜有人关注。然而，随着益生元的消耗如NDO对怀孕期间生理上的好处是明确的(van Vlies et al., 2012)。正是在这样的背景下，本研究中，增加了一个新的观察对象：母体补充菊粉确实减轻大鼠母体以及胎儿大脑神经毒物诱导的氧化应激和神经毒性。我们选择ACR作为模型神经毒物：一是其发育神经毒性在实验动物是已证明的（Fergusonetal，2010; Pedersenetal，2012）；二是随着富含碳水化合物的热加工食物消费量增加，人类通过饮食长期低剂量接触ACR(Riboldi et al., 2014)。

为了检验我们的工作假设，最初我们建立了ACR亚致死剂量基础数据及其对母鼠的大脑区域和胎儿大脑氧化状态、抗氧化防御和神经毒性响应方面的影响。氧化自由基的产生和许多其他的因素(Zhang et al., 2011; Prasad and Muralidhara, 2013)的涉及已经在接触ACR的啮齿动物大脑得到证明。在本模型中，我们证明ACR接触对母体大脑和胎儿大脑区域有显著氧化损伤。氧化应激标记物的增强和几个抗氧化酶水平扰动表明ACR神经毒性可能或者至少部分是通过生产氧化应激物质介导的。增强ROS产生可能是由于发育中的胎儿的大脑解毒系统效率低。同样的，前期研究表明母体接触ACR后增加后代的大脑对ACR神经毒性的敏感性(Takahashi et al., 2009; Allamet al., 2011)。 悉知2型烯烃包括ACR通过影响神经传递，与神经末梢交互，从而干扰信号传导途径(LoPachinet al., 2004)。本研究中ACR接触明显增强胎儿的大脑。丝氨酸水解酶（乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶）的活性。胆碱酯酶活性的改变可能是指示突触形成时关键调节过程受到影响的潜在的标记，因为胆碱酯酶被认为参与调节发育中的神经系统的胆碱能传输、神经突生长和细胞增殖(Brimijoin and Koenigsberger, 1999)。

母体膳食控制被认为是确定胎儿发育和妊娠结果的有益实践策略(Al-Gubory et al., 2010)。在这方面，采用非消化性寡糖的母体饮食干预靶向肠——脑轴可能代表一种新的策略来实现神经保护作用。为了获得母体接触ACR具有诱导胎儿大脑氧化功能障碍的证据，接下来我们试图评估怀孕期间母体补充菊粉是否对胎儿和母体大脑有神经保护的作用。首先，我们监测了开放的领域母体探索行为（GD14）的实验，因为ACR接触导致特定的行为表现型。数据显示，ACR处理的母鼠在开放领域的中心区域出现的条目数/时间频率减少。有趣的是，补充菊粉ACR母鼠在中心区域的探索增强，虽然在总持续时间上没有影响。

可想而知, 菊粉介导调节大脑区域内其他神经递质受体和途径(或其他不确定的过程)，这些受体和途径调节动机和/或可能促成跨两个探索性测试领域的差异。我们推测母鼠在中心区域探索活动的增强可能与菊粉补充导致的双歧杆菌数选择性增殖有关。我们观察到菊粉补充并没有增加盲肠重量，但是研究已经表明在动物模型中寡聚糖的补充导致盲肠重量显著增加，于是我们推测，这一效果可能与菊粉补充剂的剂量和持续时间有关。再者，我们不排除菊粉造成其他固有细菌菌株增强定植的可能性。我们的猜测得到之前关于小鼠中益生菌鼠李糖乳杆菌（LR JB-1）抗焦虑影响报告的支持。(Bravo et al., 2011)

最近，一些研究人员已经证实肠道菌群和大脑功能之间的联系(Savignac et al., 2013; Heijtz et al., 2011)。虽然通过该菊粉诱导改变探索行为确切的机制从本研究不能清楚地得知，但是可以合理推测通过提高双歧杆菌数量来介导。这种思路符合最近的研究结果，研究显示神经活性物质（GABA）和抗焦虑行为有关的迷走神经与肠道菌群的增殖有关(Bercik et al., 2011)。此外,抗焦虑的作用可能源于改变脑衍生神经营养因子(BDNF)表达,这一点支持了益生元增加营养支持的可用性的论题(Savignac etal .,2013)。然而，还需要进一步研究，以更好地了解在缓解神经毒物引起的不良表型增强菌群的作用。然而,还需要进一步的研究来更好地理解增强微生物群在缓解神经毒物诱导不良表型的作用。

在目前的研究中,菊粉补充明显减少ACR母鼠和胎儿的大脑区域活性氧和MDA的水平，降低母鼠大脑区域蛋白质羰基化反应、增强抗氧化酶活性。这些发现与表明菊粉体外抗氧化的潜能(Stoyanova et al., 2011)和体内高果糖饮食下低聚果糖清除ROS的效力的(Van denEnde et al., 2011)报告是一致的。菊粉对四氯化碳和细菌内毒素（LPS）诱导的毒性相似的保护作用（Liuet al., 2015; Pasqualetti et al., 2014)。此外，在本模型中，菊粉补充恢复ACR母鼠硫氧还蛋白还原酶的活性水平，这是受损的硒蛋白可能代表大脑发育损伤的介质的证据重要(Soerensen et al .,2008)。

此外，菊糖补充剂显著可防止胎儿大脑乙酰胆碱酯酶的活性增强，这表明它可能对调节大脑中的胆碱能功能是有用的。但是，进一步研究菊粉补充导致这些生理效应潜在的机制是必要的。我们推测这可能与至少是部分某些最近报道某些特定微生物产生的神经代谢物质的能力(Lyte, 2011)和通过肠道微生物群和膳食成分对迷走神经刺激的作用(Forsythe et al., 2014)有关。这些发现也暗示菊粉可能有调节副交感神经功能的作用。总的来说，这些结果表明菊粉对ACR诱导的氧化应激有保护作用。与我们早些时候的报告显示一致, ACR接触与氧化损伤、线粒体功能障碍相关(Prasad and Muralidhara, 2014)。在本次研究中，我们虽然发现菊粉补充胎儿的大脑复合物I-III的活性降低，但对母鼠大脑复合物的活性水平没有明显影响。

几项研究已经表明，某些益生菌菌株具有显著的除去各种食源性诱变剂包括杂环胺类和真菌毒素的能力(Orrhage et al., 1994; Serrano-Nino et al., 2013)。最近的一项研究中，体外实验表明选定乳杆菌株有结合ACR的能力，这表明他们具有解食品污染物毒素的潜能(Serrano-Ninoet al., 2014)。这些证据表明菊粉补充剂可能影响ACR体内生物利用度，但是因为在我们的研究中我们没有测量环氧丙水平，对于明确断定菊粉对ACR代谢的影响是相当的困难的。另外，消化前体内ACR与菊粉相互作用的可能性也不能完全排除。这将值得我们在菊粉调节ACR的生物利用度的确切作用做进一步的研究。

比较鲜为人知的是，有关低聚糖对啮齿动物的中枢单胺类水平的作用。有趣的是，虽然母鼠补充菊糖并不会影响胎儿的大脑多巴胺水平，但显著提高母鼠皮层的含量。这很可能是菊粉介导增强DA水平，影响多巴胺能神经元活性。然而本研究中菊粉（与细菌数相关）调节多巴胺水平的潜在的机制仍不清楚。我们的发现支持了最近的一项研究中关于肠道固有微生物群控制神经递质翻转和氨基酸代谢 (O'Mahony et al., 2014)和胃肠道内微生物影响神经过程、大脑神经传递的假说。

总的来说，我们的研究结果表明，怀孕期间补充菊粉显著调节母体表型和显著缓解氧化诱导相关的神经毒剂。此外，这对胎儿的大脑发育有显著效果。然而，进一步的研究应着眼于理解菊粉大幅调节母体和胎儿探索行为、改善ACR神经毒性的可能机制。

怀孕期间采用膳食的方法如益生元低聚糖来调节有益菌，用以废止胎儿发育期间神经毒性的影响提供了一种新颖的方法来理解微生物群和大脑之间的相互作用。